一种大豆小肽及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一株用于分解蛋白的蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)菌株，和利用该菌株制备大豆小肽的方法以及所得的大豆小肽，本发明还涉及一种碳酸苏打水健康饮料。

背景技术：

大豆是世界上最重要且产量最大的豆类，作为人类可食的最丰富最廉价的蛋白质来源，其所含氨基酸较全面，尤以赖氨酸为主，恰好互补了谷类蛋白质中赖氨酸的不足。亚洲人喜食大豆发酵制品，包括豆豉、豆汁、豆酱及各种腐乳等霉菌发酵产品，不但规避了困扰欧美人种的蛋白过敏症状还能通过微生物作用后消除其抑制营养的因子，同时产生多种具有持久香味的呈味肽，因而更易被人体接受并消化吸收。

伴随着近年来世界学者对功能食品的研究开发和生物技术的进步发展，大豆肽制品特别是大豆小肽功能食品受到了全球食品行业的青睐。目前，大豆小肽是大豆蛋白经水解得到的小分子肽的混合物，五肽以下的大豆小肽可穿过小肠粘膜而被人体直接吸收，其中具有生理活性小分子肽的功效是原大豆蛋白质及其所组成的氨基酸所不具备的。大豆小肽功能食品的各种保健功能如降血压、降血脂、促脂肪代谢、抗氧化、抗疲劳、促元素吸收和低致敏性等功能也逐步被发现并被广泛应用，故而开发富含大豆小肽的产品极具工业发展前景。

另外，现代人生活方式讲求快捷、高效和实用，为食用方便和感官愉悦的需求而开发并进食了大量的精米精面及其它便捷食品如高糖分碳酸汽水等，这些营养单一的饮食充斥着盐分、糖分、能量和酸，长期食用且饮水量补足时会导致营养素过度摄入和体内渗透压失衡。在这种不健康的社会饮食风潮之下，富含淡水的简单低糖低营养素的碱性健康饮料需求与日剧增。

本发明规避以往富含营养素的高浓度大豆肽饮料的宏观设计思维定势，专注于开发口感清爽的含有少量大豆小肽的低糖碱性碳酸饮料，切合了市场的需要，关照了特殊人群的需求，致力于工艺优化和开发令人感官愉悦的健康饮料，符合大众消费者的口味和多方要求。

技术实现要素：

为了解决上述问题，实现上述目标，本发明提供以下技术方案。

本发明的技术方案之一是提供一株蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)菌株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno：14049。

本发明的另一个技术方案是提供一种菌剂，其活性成分为上述的蜡样芽孢杆菌菌株。

本发明的另一个技术方案是提供上述的蜡样芽孢杆菌菌株在分解大豆蛋白或制备大豆小肽中的应用。

本发明的又一个技术方案是提供一种制备大豆小肽的方法，其包括如下步骤：

(a)称取豆粕，灭菌，接种蜡样芽孢杆菌，并发酵，优选地，发酵时间为15天；

(b)向步骤(a)所得的发酵豆粕加入蛋白酶进行酶解；

(c)过滤步骤(b)所得的酶解产物并静置净化，得到脱苦除臭和部分除色的大豆蛋白清液，优选地，所述过滤用400目滤布进行，优选地，所述静置净化用活性炭和弗罗里硅土进行，优选地，所述活性炭和弗罗里硅土用量为5‰和为10‰质量份数，g/kg；

(d)将步骤(c)所得大豆蛋白清液进行10000da以下超滤膜处理，再进行1000da以下纳滤膜和500da以下纳滤膜处理，收集滤出的大豆小肽含水混合液，继续对该滤出的大豆小肽含水混合液进行除水纳滤膜处理，得到大豆小肽。

进一步地，上述的制备大豆小肽的方法还包括：

(e)将步骤(d)所得的大豆小肽浓缩，再进行冷冻干燥，优选地，在浓缩之后，加入电解水进行抑菌，优选地，电解水用量为5‰。

优选地，上述的蜡样芽孢杆菌是本发明的蜡样芽孢杆菌菌株。

优选地，上述蛋白酶为嗜热菌蛋白酶，优选地，所述嗜热菌蛋白酶用量为5‰质量份数(g/kg)。

本发明的另外又一个技术方案是提供一种大豆小肽，其由上面任一项所述的方法制备而得。

本发明的再一个技术方案是提供一种饮料，按重量份数，其包括如下成分：

大豆小肽1-5份，优选地，所述大豆小肽为上述的大豆小肽；

柠檬酸10-12份，优选地，所述柠檬酸为一水柠檬酸；

木糖醇60-70份；

小苏打7.5-8份；

水1500份。

在一种实施方案中，所述饮料如下成分：

大豆肽3份；

柠檬酸10份；

木糖醇60份；

小苏打7.5份，

水1500份。

通常而言，蜡样芽孢杆菌是常见的致病菌，在自然界分布广泛，在各种食品中的检出率也较高，往往是食品在食用前保存温度不当，放置时间过长，使污染在食品中的蜡样芽孢杆菌或残存的芽孢得以生长繁殖，或是由于含有蜡样芽孢杆菌产生的热稳定毒素，而导致食物中毒的发生。中毒的发病率较高，一般为60％～100％。因而，鲜有蜡样芽孢杆菌用于食品生产的案例。

然而，蜡样芽孢杆菌可产生细菌蛋白酶，具有有效降解或分解大豆蛋白的能力，本发明正是基于此，分离了一株具有较强蛋白分解能力的新的蜡样芽孢杆菌，并开发出一种生产大豆小肽的新工艺。

本发明的有益效果是：

(1)本发明分离的高活性蜡样芽孢杆菌具有强的蛋白分解能力，酶活力＝184.79u/ml，能把豆粕中的蛋白质分解为分子量较小的各种短肽。

(2)本发明在分离到了高活性蜡样芽孢杆菌的基础上，开发了一种发酵豆粕提取小分子肽的新工艺，通过发酵、水解、脱色除臭、分离、提取等方法，利用工业炼制大豆油的压榨浸提副产物二浸豆粕开发可食用的高经济附加值的大豆小肽及其相关产品，副产物还可以继续作为饲料使用，充分提高了大豆蛋白的综合利用价值。

(3)本发明还开出了含有从发酵二浸豆粕的大豆蛋白中提取的小分子量肽的一种低苦涩、低腥臭味的无糖碳酸苏打水健康饮料，可在保持清爽口感的前提下迅速补充人体缺失的水分。在不增加糖份摄入的基础上还能兼顾口感、味觉、碱性和微量的营养，不含分散剂和稳定剂，是一种健康的饮品。

附图说明

结合附图以及对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。

图1为本发明的蜡样芽孢杆菌菌株培养3天后的肉眼观察结果，即平板菌落形态。

图2为本发明的蜡样芽孢杆菌菌株培养3天后的显微镜观察结果，即革兰氏染色后的形态。

图3为不同孔径超滤膜筛选出来的不同分子量的大豆小肽混合产物的液相色谱图。

具体实施方式

实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。

实施例1.本发明蜡样芽孢杆菌的分离、表征、培养和保藏

1.1菌株分离

称取10g豆豉粉于250ml锥形瓶中，加无菌生理盐水100ml，震荡2-4小时，静止沉淀，得到上清液，取出10ml进行稀释，菌液稀释至10^-7，分别取10^-1、10^-3、10^-3、10^-7这几个梯度进行平板涂布实验，涂布于酪蛋白培养基上，37℃下培养24小时，观察是否产生透明圈。挑取产生透明圈的9株单菌落于分离培养基中进行划线，纯化菌株，最后斜面保藏9株菌株，接下来进行酶活实验。根据透明圈的大小以及酶活力大小挑选酶活力最高的菌株，即本发明的菌株。

1.2菌株表征

(1)形态特征

在普通琼脂平板培养基上，37℃，培养24小时，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5-7mm。在m.s.p培养基上生长更旺盛，菌落直径达8-10mm，更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。在蛋白胨酶母膏平板上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大。

图1为本发明的蜡样芽孢杆菌菌株培养3天后的肉眼观察结果。

图2为本发明的蜡样芽孢杆菌菌株培养3天后的显微镜观察结果。

(2)16srna序列pcr产物

首先，先鉴定是阳性菌还是阴性菌(我们菌株为阳性菌)，再按照通用的阳性菌提取dna的方法提取菌株的dna，利用16srna通用引物27f和1492r进行pcr，得到的产物进行基因测序。

测序结果如下所示：

gcatgggggcagctatacatgcagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtgatttaattcgaagcaacgcgaagaacccttaccaggtcttgacatcctctgacacccttagagatagggcttctcctttcgggagcagagtgacagtgctgcatgattgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggattagtcctgcaacgagcgcactcatgatcttagctgcatcattagcttgagcacttctaagtgaactgacggtgaacaaccggaag(seqidno：1)

其次，进行genbank申请，得到菌株编号为ky419575。然后进行序列比对，比对结果是和蜡样芽孢杆菌相似度达到99％，因此，本发明的菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌。

1.3培养条件

筛选产蛋白酶的培养基：

脱脂奶粉4g、kh2po40.36g、na2hpo41.07g、zncl20.04g、cacl20.002g、mgso40.5g、feso40.02g、nacl0.16g、胰蛋白胨0.04g、琼脂10g、蒸馏水1000ml，121℃灭菌20分钟。

保藏培养基(lb培养基)：

牛肉膏2.5g、蛋白胨5g、氯化钠2.5g、琼脂10g、蒸馏水500ml，121℃灭菌20分钟。

培养温度：28～35℃。

1.4保藏说明

菌株名称：蜡样芽孢杆菌；

拉丁名称：bacilluscereus；

保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称cgmcc；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2017年04月19日；

保藏中心登记入册编号：cgmccno：14049。

实施例2.大豆小肽的制备

实施例2.1

大豆小肽按照以下步骤制备而成：

(a)称取二浸豆粕，加入水，高压蒸汽灭菌，接种本发明的蜡样芽孢杆菌于发酵罐内密闭发酵72小时；

(b)将步骤(a)所得发酵豆粕加入水，待充分浸润后加入嗜热菌蛋白酶(thermolysin)进行酶解，后超声浸提得到酶解液，嗜热菌蛋白酶用量为5‰质量份数(g/kg)；

(c)将步骤(b)所得酶解液过400目滤布除去颗粒物后，加入活性炭和弗罗里硅土静置半小时后净化，再经板框压滤机过滤除去活性炭和弗罗里硅土，得到脱苦除臭和部分除色的大豆蛋白清液，活性炭和弗罗里硅土用量为5‰和为5‰质量份数(g/kg)；

(d)将步骤(c)所得大豆蛋白清液进行10000da超滤膜处理后，收集滤出的无菌大豆小肽粗含水混合液，再对该大豆小肽粗含水混合液进行1000da纳滤膜和500da纳滤膜处理后，收集滤出大豆小肽含水混合液，继续对该滤出大豆小肽含水混合液进行除水纳滤膜处理后，收集未滤出组分溶液为大豆小肽混合浓缩液，滤出组分过csmre2540-te滤膜收集水相滤液，再经121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

(e)将步骤(d)所得大豆小肽混合浓缩液浓缩后加入电解水抑菌，电解水用量为5‰的质量份数(g/kg)，再进行冷冻干燥，获得1000da、500da和＜500da的粉状大豆小肽混合物，该混合物同时含有大豆分离基础氨基酸。

实施例2.2

大豆小肽按照以下步骤制备而成：

(a)称取二浸豆粕，加入水，高压蒸汽灭菌，接种本发明的蜡样芽孢杆菌于发酵罐内密闭发酵36小时；

(b)将步骤(a)所得发酵豆粕加入水，待充分浸润后加入嗜热菌蛋白酶(thermolysin)进行酶解，后超声浸提得到酶解液，嗜热菌蛋白酶用量为3‰质量份数(g/kg)；

(c)将步骤(b)所得酶解液过400目滤布除去颗粒物后，加入活性炭和弗罗里硅土静置半小时后净化，再经板框压滤机过滤除去活性炭和弗罗里硅土，得到脱苦除臭和部分除色的大豆蛋白清液，活性炭和弗罗里硅土用量为7‰和为10‰质量份数(g/kg)；

(d)将步骤(c)所得大豆蛋白清液进行10000da超滤膜处理后，收集滤出的无菌大豆小肽粗含水混合液，再对该大豆小肽粗含水混合液进行1000da纳滤膜和500da纳滤膜处理后，收集滤出大豆小肽含水混合液，继续对该滤出大豆小肽含水混合液进行除水纳滤膜处理后，收集未滤出组分溶液为大豆小肽混合浓缩液，滤出组分过csmre2540-te滤膜收集水相滤液，再经121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

(e)将步骤(d)所得大豆小肽混合浓缩液浓缩后加入电解水抑菌，电解水用量为10‰的质量份数(g/kg)，再进行冷冻干燥，获得1000da、500da和＜500da的粉状大豆小肽混合物，该混合物同时含有大豆分离基础氨基酸。

实施例2.3

大豆小肽按照以下步骤制备而成：

(a)称取二浸豆粕，加入水，高压蒸汽灭菌，接种本发明的蜡样芽孢杆菌于发酵罐内密闭发酵72小时；

(b)将步骤(a)所得发酵豆粕加入水，待充分浸润后加入嗜热菌蛋白酶(thermolysin)进行酶解，后超声浸提得到酶解液，嗜热菌蛋白酶用量为4‰质量份数(g/kg)；

(c)将步骤(b)所得酶解液过400目滤布除去颗粒物后，加入活性炭和弗罗里硅土静置半小时后净化，再经板框压滤机过滤除去活性炭和弗罗里硅土，得到脱苦除臭和部分除色的大豆蛋白清液，活性炭和弗罗里硅土用量为5‰和为2‰质量份数(g/kg)；

(d)将步骤(c)所得大豆蛋白清液进行10000da超滤膜处理后，收集滤出的无菌大豆小肽粗含水混合液，再对该大豆小肽粗含水混合液进行1000da纳滤膜和500da纳滤膜处理后，收集滤出大豆小肽含水混合液，继续对该滤出大豆小肽含水混合液进行除水纳滤膜处理后，收集未滤出组分溶液为大豆小肽混合浓缩液，滤出组分过csmre2540-te滤膜收集水相滤液，再经121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

(e)将步骤(d)所得大豆小肽混合浓缩液浓缩后加入电解水抑菌，电解水用量为7‰的质量份数(g/kg)，再进行冷冻干燥，获得1000da、500da和＜500da的粉状大豆小肽混合物，该混合物同时含有大豆分离基础氨基酸。

实施例2.4

大豆小肽按照以下步骤制备而成：

(a)称取二浸豆粕，加入水，高压蒸汽灭菌，接种本发明的蜡样芽孢杆菌于发酵罐内密闭发酵48小时；

(b)将步骤(a)所得发酵豆粕加入水，待充分浸润后加入嗜热菌蛋白酶(thermolysin)进行酶解，后超声浸提得到酶解液，嗜热菌蛋白酶用量为5‰质量份数(g/kg)；

(c)将步骤(b)所得酶解液过400目滤布除去颗粒物后，加入活性炭和弗罗里硅土静置半小时后净化，再经板框压滤机过滤除去活性炭和弗罗里硅土，得到脱苦除臭和部分除色的大豆蛋白清液，活性炭和弗罗里硅土用量为2‰和为7‰质量份数(g/kg)；

(d)将步骤(c)所得大豆蛋白清液进行10000da超滤膜处理后，收集滤出的无菌大豆小肽粗含水混合液，再对该大豆小肽粗含水混合液进行1000da纳滤膜和500da纳滤膜处理后，收集滤出大豆小肽含水混合液，继续对该滤出大豆小肽含水混合液进行除水纳滤膜处理后，收集未滤出组分溶液为大豆小肽混合浓缩液，滤出组分过csmre2540-te滤膜收集水相滤液，再经121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

(e)将步骤(d)所得大豆小肽混合浓缩液浓缩后加入电解水抑菌，电解水用量为5‰的质量份数(g/kg)，再进行冷冻干燥，获得1000da、500da和＜500da的粉状大豆小肽混合物，该混合物同时含有大豆分离基础氨基酸。

实施例2.5

大豆小肽按照以下步骤制备而成：

(a)称取二浸豆粕，加入水，高压蒸汽灭菌，接种本发明的蜡样芽孢杆菌于发酵罐内密闭发酵60小时；

(b)将步骤(a)所得发酵豆粕加入水，待充分浸润后加入嗜热菌蛋白酶(thermolysin)进行酶解，后超声浸提得到酶解液，嗜热菌蛋白酶用量为2‰质量份数(g/kg)；

(c)将步骤(b)所得酶解液过400目滤布除去颗粒物后，加入活性炭和弗罗里硅土静置半小时后净化，再经板框压滤机过滤除去活性炭和弗罗里硅土，得到脱苦除臭和部分除色的大豆蛋白清液，活性炭和弗罗里硅土用量为10‰和为5‰质量份数(g/kg)；

(d)将步骤(c)所得大豆蛋白清液进行10000da超滤膜处理后，收集滤出的无菌大豆小肽粗含水混合液，再对该大豆小肽粗含水混合液进行1000da纳滤膜和500da纳滤膜处理后，收集滤出大豆小肽含水混合液，继续对该滤出大豆小肽含水混合液进行除水纳滤膜处理后，收集未滤出组分溶液为大豆小肽混合浓缩液，滤出组分过csmre2540-te滤膜收集水相滤液，再经121℃高压蒸汽灭菌30分钟；

(e)将步骤(d)所得大豆小肽混合浓缩液浓缩后加入电解水抑菌，电解水用量为2‰的质量份数(g/kg)，再进行冷冻干燥，获得1000da、500da和＜500da的粉状大豆小肽混合物，该混合物同时含有大豆分离基础氨基酸。

实施例2.1所得大豆小肽的液相色谱图如图3所示，这是用不同孔径超滤膜筛选出来的不同分子量的大豆小肽混合物的液相色谱图。(a)，10000da滤出液的液相色谱图和5000da滤出液的液相色谱图；(b)，1000da滤出液的液相色谱图和500da滤出液的液相色谱图。高效液相色谱条件为：cosmosil5c18-arii色谱柱(4.6mm×250mm)，梯度式洗脱(0％～80％乙腈％，60分钟)，流动相a为添加0.1％tfa的milliq超纯水，流动相b为纯乙腈，流速为0.5ml/min，检测波长为220nm，柱温为35℃。

谱图精细结构说明分子量越小的滤出液，色谱峰信息越丰富，小肽的数量越少，浓度越高。

实施例2.2-2.5所得的大豆小肽产物的液相色谱图同图3类似。

实施例3.碳酸苏打水饮料的制备

本发明所述的碳酸苏打水饮料的制备方法主要包括以下步骤：

(a)按重量份数称取原料：实施例2.1制得的大豆小肽1-5份，水1500份，柠檬酸10-12份，木糖醇60-70份，小苏打7.5-8份；

(b)将上述原料混合后充入二氧化碳至饱和，灌装封盖并储存。

下面通过下述实施例对该制备方法做进行进一步阐述。

实施例3.1

本实施例提供饮料原料的重量份数：大豆小肽1份(500da以下)，水1500份，柠檬酸12份，所述柠檬酸为一水柠檬酸，木糖醇70份，小苏打8份，所述小苏打为碳酸氢钠，充入二氧化碳至饱和，灌装封盖并储存。

实施例3.2

本实施例提供饮料原料的重量份数：大豆小肽3份(1000da以下)，水1500份，柠檬酸10份，所述柠檬酸为一水柠檬酸，木糖醇60份，小苏打7.5份，所述小苏打为碳酸氢钠，充入二氧化碳至饱和，灌装封盖并储存。

实施例3.3

本实施例提供饮料原料的重量份数：大豆小肽5份(1000da以下)，水1500份，柠檬酸11份，所述柠檬酸为一水柠檬酸，木糖醇65份，小苏打7.5份，所述小苏打为碳酸氢钠，充入二氧化碳至饱和，灌装封盖并储存。

实施例3.4

本实施例提供饮料原料的重量份数：大豆小肽5份(过csmre2540-te滤膜收集水相滤液的干燥粉，500da以下)，水1500份，柠檬酸11份，所述柠檬酸为一水柠檬酸，木糖醇60份，小苏打8份，所述小苏打为碳酸氢钠，充入二氧化碳至饱和，灌装封盖并储存。

感官评价试验例

本发明实施例3.1-3.4分别标记为1-4号，对大豆小肽碳酸苏打水饮料风味、口感、色泽、甜度、酸度、澄清度和总体可接受度进行感官评定，获得有效样本51个，实验结果数据如下表所示：

从上表可知，无经验型的感官评定员，即普通消费者对本发明的实施例3.1-3.4的碳酸型大豆小肽苏打水饮料喜好程度为喜欢，仅部分稍微喜欢，对肽味也没有显著感觉。

另外，本发明中使用的过滤膜为食品工业生产中使用的超滤膜和纳滤膜，充入二氧化碳的机器为市售苏打水机；本发明中使用的柠檬酸、木糖醇、小苏打均为市售产品，柠檬酸可由鲜榨柠檬汁代替。

以上所述仅是本发明的具体实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以具体实施例公开如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述公开的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110>上海海洋大学

<120>一种大豆小肽及其制备方法与应用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1150

<212>dna

<213>蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）

<400>1

gcatgggggcagctatacatgcagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagt60

tagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgg120

gaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggc180

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