一种克隆胚胎处理液及其使用方法以及该处理液的用途与流程

本发明涉及体细胞克隆技术，特别涉及一种克隆胚胎处理液及其使用方法以及该处理液的用途。

背景技术：

体细胞克隆(somaticcellnucleartransfer，scnt)，又称体细胞克隆，是用于生产动物的一种辅助生殖技术。scnt指的是将供体体细胞移植到去核的卵母细胞的细胞质中，通过融合并激活从而获得重构胚，使细胞恢复分裂，继续发育得到与供体细胞基因型完全相同的后代。

通过体细胞克隆技术可以将单个分化的体细胞的细胞核在离体环境中培养得到整个生物机体,这对于农业技术、生物医药行业、濒危物种保护来说具有巨大的潜力(yangetal.,2007)。在畜牧业上，可以通过建立优良家畜的细胞系作为核供体进行动物克隆，避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，使育种年限大大缩短，动物育种的进程随之加速，促进优良畜群繁育。在生物医学上，用于克隆家畜和转基因动物的体细胞克隆技术是非常有价值的(meurensetal.,2012)。克隆干细胞经诱导分化后，构成相应的组织器官，用于组织或器官移植的供体，或者通过体细胞克隆技术生产转基因动物作为生产人类药物蛋白的生物反应器。通过体细胞克隆技术可用于制备基因修饰动物，体细胞克隆技术已成为目前生产基因修饰动物的主要技术手段，特别是转基因大动物的生产，例如生产表达人α-乳清蛋白的转基因山羊(fengetal.,2015)和表达绿色荧光蛋白的转基因猪(hyunetal.,2003)和牛(aratetal.,2001；rosenetal.,1999)。借助体细胞克隆技术拯救濒临灭绝的珍稀物种，可通过冷冻长期保存体细胞，并在需要的时候恢复，这极大提高了保护珍稀物种的简便性，并且降低了成本，在保护物种多样性方面发挥了重要作用，而且有望利用该技术增加珍稀物种的存活数量。

现在，对于体细胞去分化重编程为多能性状态的研究主要集中于如何利用体细胞生产类胚胎干细胞用于再生性治疗。胚胎干细胞(embryonicstemcell,esc)具有完整的全能性并且可以分化成所有细胞类型(buehretal.,2008；evansetal.,1981)，甚至在特定培养条件下分化为胎盘细胞(murakamietal.,2011)。它们高活力的染色质结构(gaspar-maiaetal.,2011)和活跃的染色体转录活性(efronietal.,2008)使它们有别于分化的体细胞(meissner,2010)。但是，从更宽广的层面上说，esc似乎可以看作一种体细胞，因为它们与其它体细胞或移植后的胚胎共有一些重要特征。由于多能性的esc可以作为体外疾病建模和细胞/组织替代疗法有价值的细胞来源(yangetal.,2007)，而它可以从体细胞克隆技术中建立(wakayamaetal.,2001)，因此，对于人类治疗学来说体细胞克隆技术是一种很有前途的技术(hochedlingeretal.,2003)。dahl等(dahletal.,2010)已经证实了在es细胞衍生过程中，其导致组蛋白赖氨酸h3k4三甲基化(h3k4me3)和h3k27三甲基化(h3k27me3)发生明显变化，强调了表观遗传重编程与胚胎干细胞的衍生有关。正因为这一优势，使用esc进行体细胞克隆，往往有着较高的克隆效率，但其效率依然不高。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种克隆胚胎处理液，另一个目的是提供一种该处理液的使用方法，还有一个目的是提供该处理液的用途。

根据本发明的一个方面，提供了一种克隆胚胎处理液，由bix-01294和pzm培养液构成，pzm培养液中bix-01294的浓度为5nm～500nm；其中，pzm培养液由以下组分组成：

在一些实施方式中，克隆胚胎处理液ph为7.2～7.4，渗透压为288±2mosm。

在一些实施方式中，bix-01294的浓度为50nm～500nm。

根据本发明的另一个方面，提供了一种上述克隆胚胎处理液的使用方法，包括以下步骤：

(1)收集猪卵巢，放入含有1％双抗的28-39℃生理盐水的保温瓶内，首先用39℃的生理盐水清洗干净，然后用带18号针头的10ml注射器抽取直径为4-6mm卵泡中的卵母细胞，抽取液在39℃水浴锅中静置15min,去上清液后加入dpbs重悬，静置2-3min后去上清液并重复一次，最后在体式显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹2层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体用dpbs和m199成熟培养液分别洗涤3次后，转入在培养箱中已经平衡2h并覆盖了胚胎级矿物油的的m199成熟培养液滴内或四孔板内，在39℃，5％co2饱和湿度的培养箱中成熟培养42h。

(2)将成熟培养的所述卵丘细胞-卵母细胞复合体转移到含透明质酸酶的离心管中，移液器吹打约2min后转移到30mm培养皿中，用口吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出，洗涤卵母细胞，在体式镜下挑出带有第一极体的成熟卵母细胞。

(3)将所述成熟卵母细胞，用外径100-120μm的固定针，内径为15-20μm的去核针采用盲吸法去核，具体步骤如下：在65mm无菌培养盘中滴4滴50μl大小的操作液滴，使用石蜡油覆盖，再将30个左右的卵母细胞和适量的体细胞移入其中，用固定针轻轻固定住卵母细胞，用去核针拨动卵母细胞使极体在大概5点钟的位置，然后用去核针沿3点位置刺进去，去除极体及附近的胞质，然后把针撤出，将极体和胞质吐出，随后注入一个大小合适，表面光滑的体细胞，完成胚胎重构过程。重构胚放入胚胎培养液中恢复培养1h；

(4)将所述重构胚分批转移到融合液中平衡2min后，然后每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用实心玻璃针拨动重构卵，使供核细胞和受体卵母细胞的细胞膜接触面与电极平行，施加150v/mm，100μs，2dc的直流电脉冲诱导融合、激活重构胚胎，接着用胚胎培养液洗涤3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。

(5)用培养液洗涤融合的重构胚5遍，转入预平衡好的培养液中，置于39℃、饱和湿度、低氧条件的培养箱中培养，使用所述克隆胚胎处理液对胚胎进行继续培养。

在一些实施方式中，上述步骤(5)中的低氧条件是指所述培养箱中的空气组成为5％o2+5％co2+90％n2。

在一些实施方式中，在上述步骤(5)前还包括以下步骤：

复苏细胞后，待细胞汇合度达到95％以上时，改用不含血清的dmem培养基培养过夜。次日消化，用hn操作液将离心后的细胞重悬吹打均匀，准备克隆。

根据本发明的另一个方面，提供了上述克隆胚胎处理液在降低细胞suv39h1、setdb1、dnmt1或者dnmt3a的基因表达方面的应用。

根据本发明的又一个方面，提供了上述克隆胚胎处理液在下调胚胎早期发育阶段的2cell、4cell的h3k9me2水平的应用。

采用以上技术方案的克隆胚胎处理液对克隆胚胎进行培养处理可以达到以下有益效果：

(1)能够显著降低细胞suv39h1、setdb1、dnmt1或者dnmt3a的基因表达；

(2)能够明显下调胚胎早期发育阶段的2cell、4cell的h3k9me2水平。

附图说明

图1为本发明中克隆胚胎处理液对细胞组蛋白甲基化酶相关基因表达的影响示意图。

图2为本发明中克隆胚胎处理液对细胞dna甲基化酶相关基因表达的影响示意图。

图3为本发明中克隆胚胎处理液处理组与对照组2cell、4cell免疫荧光结果图。

图4为本发明中克隆胚胎处理液对胚胎组蛋白甲基化酶相关基因表达水平示意图。

图5为本发明中克隆胚胎处理液对胚胎dna甲基化酶相关基因表达水平示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。

实验材料

1、细胞株和猪克隆胚胎

猪成体成纤维细胞(513d)采自广东温氏种猪科技有限公司水台原种猪场提供的种猪；猪克隆胚胎在广东温氏种猪科技有限公司克隆实验室制备。

2、主要试剂、耗材

rna抽提试剂盒e.z.n.a.totalrnakiti购自omega公司；胚胎rna抽提试剂盒qiagenrneasyplusmicrokit(50)购自qiagen公司；反转录试剂盒primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser购自takara公司；实时定量pcr试剂盒sybrselectmastermix购自lifetechnologies公司；普通pcr用taq酶购自广州东盛生物科技公司；dl500dnamarker购自大连宝生生物工程有限公司；溴化乙锭(ethidiumbromide,eb)购自广州康龙生物科技有限公司；琼脂糖购自invitrogen公司；dmem、胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)、0.25％胰蛋白酶购自gibco公司；bix-01294购自sigma公司；各种细胞培养用的培养皿、培养板购自corning公司；15ml和50ml离心管购自excell公司；各种规格的dnase&rnase-free带滤芯吸头及pcr管购自axygen公司；胚胎注射级水购自sigma公司；组蛋白h3k9me2及h3k9me3免疫荧光所用抗体购自abcam生物公司；mtt购自thermo公司；dapi购自cellsignaling科技公司；q-pcr引物由金唯智生物科技有限公司合成。

3、主要溶液配置

3.1细胞冻存液：60％dmem+30％fbs+10％dmso.

3.2卵母细胞成熟培养液配方(m199)：

tcm199+10％pff+10％fbs+10iu/mlhcg+10iu/mlecg+0.1mg/mll-半胱氨酸+10ng/mlegf，现配现用。

3.3显微操作液(hm)配方：

0.7696gnacl,0.0168gnahco3,0.0356gkc1,0.0162gkh2po4,0.0293gmgso4·7h2o,0.1g葡萄糖，0.0146g谷氨酰胺，0.1501g牛磺酸，0.2383ghepes,0.4gbsa,0.0065g青霉素，0.0050g链霉素，sigmah2o溶解定容至100ml。将上述成分按顺序加入混匀。调ph至7.2～7.4，渗透压为270～290mosm,0.22μm滤器过滤分装，4℃保存备用。

3.4hoechst33342配方：10ml纯水溶解100mg，浓度为10mg/ml，-20℃冻存。

4、主要仪器设备

微量核酸浓度仪(nanodrop2000，thermo，美国)

定量pcr仪(ecotm，illumina，美国)

微量移液器(eppendorf，德国)

电热恒温水浴锅(dk-s24，上海森信实验仪器有限公司)

pcr仪(杭州博日科技有限公司，中国)

水平电泳槽及电泳仪(北京市六一仪器厂，中国)

凝胶成像系统(uvp，美国)

-80℃超低温冰箱(thermo，美国)

超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，中国)

milli-q超纯水纯化系统(millipore公司，美国)

centrifuge5810r低温离心机(eppemdorf，德国)

forma3111、3131二氧化碳培养箱(thermo，美国)

te300和te2000u倒置显微镜(nikon，日本)

显微操作仪(narishige，日本)

体视显微镜配套热台(tokai，日本)

电热恒温鼓风干燥箱：森信实验仪器有限公司，上海

体视热台：东海公司(tokai)，日本

拉针仪，pn-30，narishige，日本

微断仪，mf900，narishige，日本

研磨仪，eg-400，narishige，日本

磁力搅拌器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司，上海

电子分析天平：ac11.4，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，中国

5、分析软件及网站

pcr引物设计及分析软件：primerpremier5.0,genetool

dna序列数据库：ncbi/genbank/nucleotide/ucsc/ensembl

图片处理：photoshop7.0/acdsee9.0

凝胶成像系统软件：biocaptmw

基因分析软件：mega5.05

实验方法

1、反转录及定量pcr

将细胞rna进行反转录得到cdna，具体实验方法参照翻转录试剂盒takarareversetranscriptionkit说明书进行。冰上解冻细胞rna，同时在室温(15-25℃)条件下解冻反转录试剂；去除基因组dna，按表1成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应混合液准备的充分性，在配制时应按反应数+2的量进行mastermix的配制，在42℃条件下保温2min。

表1去除基因组dna反应体系

再进行反转录反应。按照表2配制反应体系，所有操作均在冰上进行。

表2rna反转录反应体系

反应程序：7℃，15min；85℃，5s。在pcr仪上进行反应。反应结束后将反转录产物4℃短暂保存，-20℃长期保存或进行定量rt-pcr检测。

表3实时定量pcr反应体系

实时定量pcr采用lifetechnologies公司的定量反应试剂盒(sybrselectmastermix)进行实验，反应体系为10ul(见上述表3)，每次3-4个技术重复。pcr反应程序为：95℃预变性、热启动5min；45～50轮pcr循环(95℃、10s，60℃、15s，72℃、20s)；溶解曲线(95℃、15s，55℃、15s，95℃、15s)。定量引物见表4。

表4定量pcr引物设计

2、数据处理及统计分析

基因相对表达数据分析中，各基因ct值经过内参基因(β-actin)和对照样品正态化处理后，用2^-△△ct方法计算相对表达量。具体做法是将每组样品目的基因ct均值减去内参基因ct均值得到△ct值，将其中一组样品△ct值作为参照，将其它处理样品△ct值减去参照组样品△ct值得到各组样品的△△ct值，最后将每个处理样品相对参照组样品的目的基因表达量用2^-△△ct表示。采用spss17.0进行数据处理，利用卡方检验进行显著性检验。概率值p<0.05时，平均值显著差异。

一、克隆胚胎处理液对猪成体成纤维细胞克隆及其早期胚胎发育能力比较实验

pzm培养液(胚胎培养液)的配制：

取200mlsigmah2o，按顺序加入以下成分：3.156gnacl,1.053gnahco3,0.373gkc1,0.024gkh2po4,0.049gmgso4·7h2o,0.308g乳酸钙，0.011g丙酮酸钠，0.073gl-谷氨酰胺，0.273g亚牛磺酸，10mlbme,5mlmem,0.033g青霉素，0.025g链霉素，混匀后调节ph为7.2～7.4，渗透压为288±2mosm，定容至500ml，4℃保存备用。

称取计算量的bix-01294盐酸盐添加到pzm培养液溶解后，即可得到克隆胚胎处理液。

1、卵母细胞的收集及体外成熟培养

从屠宰收集猪卵巢，放入含有1％双抗的28-39℃生理盐水的保温瓶内，4h内送回实验室。首先用39℃的生理盐水清洗干净，然后用带18号针头的10ml注射器抽取直径为4-6mm卵泡中的卵母细胞，抽取液在39℃水浴锅中静置15min,去上清液后加入dpbs重悬，静置2-3min后去上清液并重复一次。在体式显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹2层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体(cumulusoocytecomplexes，cocs)，用dpbs和m199成熟培养液分别洗涤3次后，转入在培养箱中已经平衡2h并覆盖了胚胎级矿物油的的m199成熟培养液滴内或四孔板内。39℃，5％co2饱和湿度的培养箱中成熟培养42h。

2、去除颗粒细胞

将成熟培养的cocs转移到含透明质酸酶的离心管中，移液器吹打约2min后转移到30mm培养皿中，用口吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出。洗涤卵母细胞，在体式镜下挑出带有第一极体的成熟卵母细胞备用。

3、供体细胞的预处理

为了提高重构胚的融合率，需对供体细胞做血清饥饿和接触抑制处理。复苏细胞后，待细胞汇合度达到95％以上时，改用不含血清的dmem培养基培养过夜。次日消化，用hn操作液将离心后的细胞重悬吹打均匀，准备克隆。

4、猪成体成纤维细胞克隆

挑选已排出第一极体且形态良好的卵母细胞，用外径100-120μm的固定针，内径为15-20μm的去核针采用盲吸法去核。具体步骤如下：在65mm无菌培养盘中做4滴50μl大小的操作液滴中，石蜡油覆盖，将30个左右的卵母细胞和适量的体细胞移入其中，用固定针轻轻固定住卵母细胞，用去核针拨动卵母细胞使极体在大概5点钟的位置。然后用去核针沿3点位置刺进去，去除极体及附近的胞质，然后把针撤出，将极体和胞质吐出，随后注入一个大小合适，表面光滑的体细胞，完成胚胎重构过程。重构胚放入胚胎培养液中恢复培养1h。

将恢复培养1h的重构胚分批转移到融合液中平衡2min后，用融合/激活液洗涤3遍，然后每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用拉制的、极细的实心玻璃针拨动重构卵，使供核细胞和受体卵母细胞的细胞膜接触面与电极平行，施加150v/mm，100μs，2dc的直流电脉冲诱导融合、激活重构胚胎，接着用胚胎培养液洗涤3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养，4h后在体视显微镜下判定融合情况并计算融合率。

5、采用克隆胚胎处理液培养24h后的胚胎23-24h

bix-01294盐酸盐添加到pzm培养液中分别配制成5nm、50nm、500nm的克隆胚胎处理液。用pzm培养液洗涤融合的重构胚5遍，转入预平衡好的培养液中，置于39℃、饱和湿度、低氧(5％o2+5％co2+90％n2)条件的培养箱中培养。在胚胎融合激活时记为0天，将克隆胚胎处理液在第1天早上8点分别转入预平衡好的新四孔板中，克隆胚胎处理液处理时间为23-24h，第2天早上8点结束该药物处理时间，对胚胎进行换液后继续培养。药物处理的不同浓度分组情况如下表表5。第2天和第6天分别观察并记录卵裂数和囊胚数等克隆效率相关数据。

表5克隆胚胎处理液处理胚胎23-24h组别

6、克隆胚胎处理液处理胚胎16-17h

用培养液洗涤融合的重构胚5遍，转入预平衡好的培养液中，置于39℃、饱和湿度、低氧(5％o2+5％co2+90％n2)条件的培养箱中培养。在胚胎融合激活时记为0天，胚胎融合4h后分别转入预平衡好的新四孔板中，克隆胚胎处理液处理时间为16-17h，然后结束该药物处理时间，对胚胎进行换液后继续培养。药物处理的不同浓度分组情况如下表6。第2天和第6天分别观察并记录卵裂数和囊胚数等克隆效率相关数据。

表6克隆胚胎处理液处理胚胎16-17h组别

两种方案均培养至第6天早上，每组每次收集5-10个囊胚进行核染色统计囊胚内总细胞数，经hn操作液洗涤后，放入含10μg/mlhoechst33342的dpbs中避光染色10min，接着将囊胚微滴转移到干净的载玻片上，轻盖上盖玻片，使囊胚受压后膨大但不至于破碎，用指甲油封片。置于荧光显微镜下观察，计算单个囊胚内的总细胞数目。另外，每组每次另外收集6-10个胚胎混合装至50μl的rlt裂解液中，盖好离心管盖，用parafilm膜封口，迅速丢入液氮中速冻，-80℃保存，干冰运输，用于胚胎rna抽提。

采用spss17.0进行数据处理，利用卡方检验比较对照组和5nm、50nm、500nmbix-01294处理组进行克隆后重构胚胎的早期体外发育情况，包括融合率、卵裂率、囊胚率和囊胚平均细胞数的差异。概率值p<0.05时，平均值差异显著。

二、克隆胚胎处理液处理后对胚胎特定基因表达水平检测

1、胚胎的收集

准备好装有50μl的rlt裂解液的离心管，发育到囊胚时从四孔板中取出6-10个胚胎放于离心管中，用parafilm膜封口，迅速丢入液氮中速冻，-80℃保存。

2、胚胎rna抽提

收集的胚胎用于rna抽提，胚胎rna的提取采用qiagen的rneasyplusmicrokit(50)试剂盒。具体操作如下：

(1)胚胎样品预处理。39℃水浴解冻1～2min，简易离心。向裂解液中添加5μl，4ng/μl的carrierrna，再加入1μlβ-巯基乙醇，混匀，涡旋30s，简易离心。

(2)转移预混液至allprepdnaspincolumn，8000×g或≥10,000rpm离心30s。

(3)向(2)中收集管内滤液里加入等体积的70％乙醇溶液，吹打混匀。

(4)将(3)中收集管的乙醇混合液转移至到rneasyminelutespincolumn，8000×g或≥10,000rpm离心15s，倒掉滤液。

(5)向柱子里添加700μlbufferrw1，8000×g或≥10,000rpm离心15s，倒掉滤液。

(6)向柱子里添加500μlbufferrpe，8000×g或≥10,000rpm离心15s，倒掉滤液。

(7)向柱子里添加500μl80％乙醇，离心15s，小心取出柱子、弃去收集管。

(8)将柱子安装到一根新的2ml收集管，间隔放置、打开盖子，全速离心5min。

(9)洗脱rna：将柱子安装到试剂盒自带的1.5ml收集管，将14μlrnase-freewater直接加至离心柱膜的中心位置，轻盖盖子，全速离心1min，-80℃保存rna或立刻进行反转录。

胚胎rna反转录及定量pcr按照步骤2.3.2.6进行，检测胚胎特定基因(dnmt1、dnmt3a、dnmt3b、nanog、sox2、cdx2、bmp4、esrrb、kdm1a、xist、oct4)的表达水平。比较各组克隆胚特定基因表达量的差异。定量引物见表7。

表7胚胎定量pcr引物设计

3、数据处理及统计分析

基因组相对表达数据分析中，各基因ct值经过内参基因(β-actin)和对照样品正态化处理后，用2^-δδct方法计算相对表达量。采用spss17.0进行数据处理，利用卡方检验。概率值p<0.05时，平均值差异显著。

三、免疫荧光法检测克隆胚胎中组蛋白h3k9me2表达水平

将第六天收集的囊胚放入预热的0.5％链酶蛋白酶中作用1min去透明带，去除透明带后用dpbs-0.1％pva洗涤3次，15min；加入固定剂(用dpbs稀释的4％pfa)，室温孵育15min后用dpbs-0.1％pva洗涤3次，15min；加入穿孔液(用dpbs稀释的0.5％tritionx-100)室温孵育30min后用dpbs-0.1％pva洗涤3次，15min；加入封闭液(用dpbs稀释的1％bsa)，4℃过夜。加入用1％bsa稀释的一抗稀释液，39℃孵育1h后用dpbs-0.1％pva洗涤12次，60min，再加入二抗稀释液(注意避光处理)39℃孵育1h后用dpbs-0.1％pva洗涤12次，60min。最后加入1μg/mlpi，室温孵育10min后用dpbs-0.1％pva几次。准备好干净的载玻片，将染色处理过后的胚胎转移上去，转移过程中尽量使操作快速并且尽量少带液体，以胚胎所在处为中心，在要放置盖玻片的胚胎周围的找到四角，滴凡士林/石蜡油，盖上盖玻片，轻压盖玻片，然后用指甲油封片，最后在nikone800荧光显微镜下观察，拍照记录。

实验结果分析

1、克隆胚胎处理液处理对猪成体成纤维细胞特异基因表达的影响

待第5代猪成体成纤维细胞贴壁后利用不同浓度的克隆胚胎处理液(bix-01294浓度分别为0、5nm、50nm、500nm)分别处理24h后收集细胞，用omega的totalrnakiti试剂盒抽提rna并反转成cdna；用q-pcr法检测猪成体成纤维细胞细胞组蛋白甲基化酶相关基因(suv39h1、g9a、setdb1)的mrna表达情况。

结果如图1显示，图1中字母不同说明差异显著a,b,c(p<0.05)。如图所示，使用bix-01294浓度为5、50nm的克隆胚胎处理液处理组细胞的suv39h1基因表达显著低于无处理对照组(p<0.05)，而500nm处理组则显著高于其余各组(p<0.05)；5、50nm的bix-01294处理细胞后,g9a的表达量均有升高的趋势，而500nm处理组g9a基因表达显著高于无处理对照组(p<0.05)；经0、5nm、50nm、500nmbix-01294处理后，setdb1的表达量均显著低于无处理对照组(p<0.05)。

2、dna甲基化酶相关基因

dna甲基化水平主要由dna甲基化转移酶互相协调发挥作用。因此，为了研究克隆胚胎处理液处理前后细胞dna甲基化是否发生重编程，对bix-01294处理前后的细胞中dnmt1、dnmt3a、dnmt3bmrna水平进行了q-pcr检测并进行比较。在第5代猪成体成纤维细胞贴壁后利用不同浓度的克隆胚胎处理液(bix-01294浓度分别为0、5nm、50nm、500nm)分别处理24h后收集细胞，试剂盒抽提rna并反转成cdna；用q-pcr法检测猪成体成纤维细胞dna甲基化酶相关基因dnmt1、dnmt3a、dnmt3b的mrna表达情况。

结果如图2所示，经5nm、50nm、500nmbix-01294的克隆胚胎处理液处理后，dnmt1的表达量显著低于未处理的对照组(p<0.05)，且5nm、50nm处理组的dnmt1表达量显著降低(p<0.05)；经5nm、50nm、500nmbix-01294处理后，dnmt3a的表达量显著低于未处理的对照组(p<0.05)，且50nm处理组的dnmt1表达量极显著降低(p<0.01)；5nmbix-01294处理细胞使dnmt3b基因表达水平显著低于未处理组(p<0.05)，而50nm、500nm处理组的dnmt3b基因表达较未处理组有降低的趋势。

3、克隆胚胎处理液对组蛋白h3k9二甲基化的影响

为了研究猪体细胞克隆胚组蛋白甲基化修饰在体细胞克隆克隆胚胎早期发育过程中的影响，因此用不同浓度的克隆胚胎处理液处理克隆胚胎24h后恢复培养，在胚胎发育到2cell及4cell时收集胚胎检测h3k9me2表达水平。

免疫荧光结果如图3所示，克隆胚胎处理液对克隆胚胎2cell、4cell的h3k9me2水平具有明显的下调作用。

4、克隆胚胎特异基因表达量的比较

4.1组蛋白甲基化酶基因

为了研究克隆胚胎处理液处理是否改变胚胎组蛋白甲基化酶相关基因的表达，5nm、50nm、500nmbix-01294的克隆胚胎处理液处理培养24h后的克隆胚胎23-24h,并在体外培养发育至囊胚阶段收集胚胎5-6个于rtl裂解液中，用qiagen的qiagenrneasyplusmicrokit(50)试剂盒抽提rna并反转成cdna；用q-pcr法检测第6天收集的囊胚组蛋白甲基化酶相关基因(suv39h1、g9a、setdb1)的mrna表达情况。

结果如图4显示，不同浓度的克隆胚胎处理液处理组胚胎的suv39h1基因表达均有所下降，且50nm、500nm处理组胚胎的suv39h1基因表达显著低于无处理对照组(p<0.05)；5nm、50nmbix-01294处理组胚胎的g9a基因表达均有下降的趋势，而500nm处理组g9a基因表达较未处理对照组有升高的趋势；经5nmbix-01294处理后，setdb1的表达量显著高于未处理对照组(p<0.05)，而50、500nmbix-01294处理组胚胎的setdb1基因表达均有下降的趋势。

4.2dna甲基化酶基因

mrna表达量结果如图5所示，经5nm、50nm、500nmbix-01294的克隆胚胎处理液处理后，dnmt1的表达量极显著高于未处理的对照组(p<0.01)，且随处理浓度的增加，dnmt1基因表达量增加；经5nm、50nm、500nmbix-01294处理后，dnmt3a的表达量极显著高于未处理的对照组(p<0.01)，且随处理浓度的增加，dnmt3a基因表达量增加；5、50nmbix-01294处理细胞使dnmt3b基因表达水平较未处理对照组有下降的趋势，而500nm处理组的dnmt3b基因表达较未处理对照组有提高的趋势。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。