本发明涉及生物
技术领域：
。具体地说，本发明涉及具有高活性的赖氨酸脱羧酶、包含该赖氨酸脱羧酶编码基因的表达载体和能够表达该赖氨酸脱羧酶的基因工程菌，以及所述赖氨酸脱羧酶、表达载体和基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的应用。
背景技术：
：1,5-戊二胺，又名尸胺、1,5-二氨基戊烷、五亚甲基二胺和尸毒素，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱，是赖氨酸在赖氨酸脱羧酶(e.c.4.1.1.18)的作用下脱羧产生的，反应为l-lysine+h+→co2+cadaverine。1,5-戊二胺具有各种各样的功能及用途。例如，在农业上，1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进雌雄蕊的发育、改善植物果实发育、提高果实产量。在医学上，它可作为一种有效治疗痢疾的药物，也是一种重要的药物中间体。在工业上，1,5-戊二胺是一种重要的化工原料；将1,5-戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料-新型尼龙，1,5-戊二胺基不依赖于石油原料的生物制造工艺可能对尼龙工业产生颠覆性的影响。尼龙66是由己二胺和己二酸1:1聚合生成，与尼龙6同为尼龙两大品种之一。目前，己二胺或其合成前体己二腈国内主要依赖进口。1,5-戊二胺与己二胺互为同系物，在结构上与己二胺非常相似，可以替代己二胺，和二元酸共聚合成具有实用性的尼龙5x(4、6、10等)。尼龙56性能媲美经典的尼龙66，而吸湿排干率、透气性、柔软度等性能更佳，可广泛应用作纤维(服装、轮胎、地毯等)和工程塑料(电子产品、汽车部件等)。尼龙54和尼龙510等其它以1,5-戊二胺为单体制成的尼龙产品具有特殊的材料性能，具有潜在的应用价值。赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸脱羧形成1,5-戊二胺，是1,5-戊二胺合成途径中的关键酶。赖氨酸脱羧酶存在于各种微生物中。目前，已经分别从大肠杆菌(e.coli)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、反刍动物月形单胞菌(selenomonasruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)和鮰爱德华氏菌(edwardsiellaictaluri)等细菌中克隆出赖氨酸脱羧酶基因。最新的研究普遍采用过表达大肠杆菌的cada来生产1,5-戊二胺。日本味之素公司的us7189543专利中保护了以二羧酸调节ph并通过细胞过表达大肠杆菌的野生型cada酶转化赖氨酸产生1,5-戊二胺，产量达69g/l。上海凯赛在其专利cn102851307a中通过在蜂房哈夫尼菌中过量表达大肠杆菌野生型cada酶来转化赖氨酸，从而实现戊二胺和下游聚合物的制备。日本味之素公司的ep3118312专利中公开了热稳定性提高的大肠杆菌cada突变位点val3、ala590和glu690。日本三井化学公司的us2015132808专利保护了多个活性增加的大肠杆菌cada突变体，然而，这些cada突变体的活性提高程度均低于20％，甚至大多数cada突变体的活性提高程度不到10％，因此这些cada突变体在实际生产上的应用价值非常有限。赖氨酸脱羧酶作为催化赖氨酸生产1,5-戊二胺的催化剂，提升赖氨酸脱羧酶的活性可以减少催化剂的用量或缩短反应时间，进而降低生产成本，对1,5-戊二胺的工业化有重要的影响，因此本领域急需提升赖氨酸脱羧酶的性能，实现1,5-戊二胺的工业化生产。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种性能提升的赖氨酸脱羧酶，以便实现1,5-戊二胺的工业化生产。在第一方面，本发明提供一种赖氨酸脱羧酶，所述赖氨酸脱羧酶是：(a)其氨基酸序列由seqidno:1所示序列突变而来，在选自下组的一个或多个氨基酸残基位点发生突变：9位、44位、88位、111位、176位和230位；其中，9位、111位、176位和230位突变可以选自其他19种氨基酸，44位的氨基酸残基突变是arg，88位的氨基酸残基突变是ser；或(b)所述赖氨酸脱羧酶与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白的功能，其中对应于seqidno:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；或(c)所述赖氨酸脱羧酶由在(a)所述的氨基酸序列的c末端和/或n末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述赖氨酸脱羧酶的功能，其中对应于seqidno:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同。在具体的实施方式中，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点突变为以下所示的氨基酸残基：9位：arg、lys、gln、asn；44位：arg；88位：ser；111位：gly、pro、ala；176位：val、ile、leu、met、phe、ala；230位：his、asn、gln、lys、arg在具体的实施方式中，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点具有以下所示的氨基酸残基：9位：arg；44位：arg；88位：ser；111位：gly；176位：val；230位：his。在具体的实施方式中，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在9位为arg，或者在44位为arg，或者在88位为ser，或者在111位为gly，或者在176为val，或者在230位为his。在第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含本发明第一方面所述的赖氨酸脱羧酶的编码序列。在第三方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的表达载体或者其基因组中整合有本发明第一方面所述的赖氨酸脱羧酶的编码序列。在优选的实施方式中，所述宿主细胞是细菌；更优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)；最优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)。在第四方面，本发明提供一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：(1)利用本发明第一方面所述的赖氨酸脱羧酶或者本发明的三方面所述的宿主细胞生产1,5-戊二胺；和(2)从(1)的体系中分离得到1,5-戊二胺。在第五方面，本发明提供一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：利用以下赖氨酸脱羧酶生产1,5-戊二胺，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列与seqidno:1所示氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有seqidno:1所述蛋白的赖氨酸脱羧酶功能，而且在对应于seqidno:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位和/或230位氨基残基发生一个或多个氨基酸残基突变；其中，利用所述赖氨酸脱羧酶生产1,5-戊二胺的产量是利用氨基酸序列如seqidno:1所示的赖氨酸脱羧酶的1.7倍以上。在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的赖氨酸脱羧酶或者本发明第二方面所述的表达载体或者本发明第三方面所述的宿主细胞在生产1,5-戊二胺中的应用。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具体实施方式发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现对野生型赖氨酸脱羧酶的特定位点进行突变可以得到活性显著提升的赖氨酸脱羧酶突变体，从而为开发优异的赖氨酸脱羧酶，进而用于1,5-戊二胺的生产提供了物质基础。在此基础上完成了本发明。赖氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶是催化赖氨酸脱羧形成1,5-戊二胺的合成途径中的关键酶。赖氨酸脱羧酶存在于各种各样的微生物中，包括但不限于大肠杆菌(escherichiacoli)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、耐碱芽孢杆菌(bacillushalodurans)、蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)、尸杆菌(bacteriumcadaveris)、伯克霍尔德氏菌(burkholderiavietnamensia)、青紫色素杆菌(chromobacteriumviolaceum)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、毛链霉菌(streptomycespolosus)等。目前，已经分别从大肠杆菌、蜂房哈夫尼菌、反刍动物月形单胞菌(selenomonasruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)和鮰爱德华氏菌(edwardsiellaictaluri)等细菌中克隆出赖氨酸脱羧酶基因。虽然可以从各种不同的微生物来源获得赖氨酸脱羧酶，但各种赖氨酸脱羧酶的特性显著不同。对这些不同来源的赖氨酸脱羧酶的不同位点进行突变得到的突变体的活性也明显不同。例如，日本三井化学公司的专利申请(us2015132808)公开了多个大肠杆菌cada突变体，然而，这些cada突变体的活性提高程度均低于20％，甚至大多数cada突变体的活性提高程度不到10％。因此，这些cada突变体在实际生产上的应用价值非常有限。本领域技术人员知晓，如果要对某种酶进行突变，以便获得活性改善的突变体，关键之处在于发现突变后可以改善活性的位点。在本发明中，对氨基酸序列如seqidno:1所示的大肠杆菌来源的野生型赖氨酸脱羧酶(cada)的特定位点进行突变，得到了活性显著提高的赖氨酸脱羧酶突变体。在具体的实施方式中，本发明人在seqidno:1所示氨基酸序列的以下一个或多个位点进行突变得到的赖氨酸脱羧酶突变体可以显著提高1,5-戊二胺的产量：9位、44位、88位、111位、176位或/和230位。在本文中，所用的术语“赖氨酸脱羧酶”或“本发明的赖氨酸脱羧酶”或“本发明的酶”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均是指从氨基酸序列如seqidno:1所示的野生型赖氨酸脱羧酶出发，在上述一个或多个位点进行突变得到的具有催化赖氨酸产生1,5-戊二胺活性并且1,5-戊二胺产量显著提高的赖氨酸脱羧酶。鉴于本发明的教导以及现有技术，本领域技术人员还应明白“本发明的赖氨酸脱羧酶”还应包括其变异形式，所述变异形式具有与“本发明的赖氨酸脱羧酶”相同或相似的功能，但其氨基酸序列与本发明实施例中的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列有少量差异。这些变异形式包括(但不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-10个，更佳地1-6个，再佳地1-3个、最佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或多个(通常为30个以内，较佳地为10个以内，更佳地为6个或3个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如，异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的6-his标签通常不会改变所得蛋白质的功能。本领域技术人员还应理解，本文所述的“本发明的赖氨酸脱羧酶”的变异形式并不包括经过突变回复成野生型赖氨酸脱羧酶的情况；换言之，本发明的赖氨酸脱羧酶的变异形式是在本发明实施例所得的赖氨酸脱羧酶的基础上作进一步突变得到的，但对应于seqidno:1所示氨基酸序列的9位、44位、88位、111位、176位或/和230位的氨基酸残基与本发明实施例所得的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列中的相同。本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，如果在本发明实施例所得的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列的一端加上6-his标签，那么所得突变体中对应于seqidno:1所示氨基酸序列的176位就可能是第182位。在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是95％以上，优选95％-98％，最优选99％以上。本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(computationalmolecularbiology)，lesk，a.m.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(biocomputing:informaticsandgenomeprojects)，smith，d.w.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(computeranalysisofsequencedata)，第一部分，griffin，a.m.和griffin，h.g.编，humanapress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(sequenceanalysisinmolecularbiology)，vonheinje，g.，学术出版社，1987和序列分析引物(sequenceanalysisprimer)，gribskov，m.与devereux，j.编mstocktonpress，纽约，1991和carillo，h.与lipman，d.，siamj.appliedmath.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：gcg程序包(devereux，j.等，1984)、blastp、blastn和fasta(altschul，s，f.等，1990)。公众可从ncbi和其它来源得到blastx程序(blast手册，altschul，s.等，ncbinlmnihbethesda，md.20894；altschul，s.等，1990)。熟知的smithwaterman算法也可用于测定相同性。多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严格性条件下能与“本发明的赖氨酸脱羧酶”的编码dna杂交的dna所编码的蛋白。本发明还包括其他多肽，如包含“本发明的赖氨酸脱羧酶”或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还应包括“本发明的赖氨酸脱羧酶”的活性片段。通常，该片段具有“本发明的赖氨酸脱羧酶”的氨基酸序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。本发明还提供“赖氨酸脱羧酶”的类似物。这些类似物与天然“本发明的赖氨酸脱羧酶”的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性蛋白。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。在本发明中，“赖氨酸脱羧酶”的保守性变异多肽指与本发明实施例中的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，但所述保守性变异多肽依然具有与本发明实施例中的赖氨酸脱羧酶相同或相似的活性，即催化赖氨酸产生1,5-戊二胺活性，并且1,5-戊二胺产量显著提高。因此，鉴于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生保守性变异的突变体。初始残基代表性的取代残基优选的取代残基ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu有鉴于此，在具体的实施方式中，本发明的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点具有以下所示的氨基酸残基：176位：val、ile、leu、met、phe、ala；111位：gly、pro、ala；9位：arg、lys、gln、asn；230位：his、asn、gln、lys、arg；44位：arg；88位：ser。在优选的实施方式中，本发明的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列在选自下组的一个或多个位点具有以下所示的氨基酸残基：176位：val；111位：gly；9位：arg；230位：his；44位：arg；88位：ser。本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本领域技术人员明白，本发明的“赖氨酸脱羧酶”还包括“赖氨酸脱羧酶”的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的“赖氨酸脱羧酶”相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。鉴于本领域现有技术和本发明的教导，本领域技术人员不难获得本发明赖氨酸脱羧酶的活性片段。例如，在本文中，“赖氨酸脱羧酶”的生物活性片段是指“赖氨酸脱羧酶”的片段，但其仍然能保持全长“赖氨酸脱羧酶”的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持全长“赖氨酸脱羧酶”的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长“赖氨酸脱羧酶”的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还可以明白，可以将本发明的赖氨酸脱羧酶制成固定化酶等其它利用形式。在本发明的赖氨酸脱羧酶的基础上，本发明还提供了编码本发明“赖氨酸脱羧酶”的多核苷酸序列或其简并的变异体。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码本发明实施例中的赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码本发明权利要求中的赖氨酸脱羧酶，但与本发明实施例中的赖氨酸脱羧酶的编码核苷酸序列有差别的核酸序列。本发明中，“赖氨酸脱羧酶”的编码多核苷酸序列可插入重组表达载体或基因组。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员可采用熟知的方法能用于构建含“赖氨酸脱羧酶”编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。本文所述的宿主细胞包括包含上述表达载体或基因组上整合了本发明“赖氨酸脱羧酶”的编码序列的宿主细胞。本发明的宿主细胞或菌株能够高效表达具有高催化性能的新型赖氨酸脱羧酶，从而提高生产1,5-戊二胺的水平。本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。在具体的实施方式中，所述菌株包括但不限于：大肠杆菌(e.coli)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌(e.coli)。用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。在上面的方法中的重组多肽可以组成型表达或条件表达，例如当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高压匀浆、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。鉴于本发明的教导和现有技术，本领域普通技术人员会理解，本发明的赖氨酸脱羧酶及其编码序列、表达载体、宿主细胞可用于催化赖氨酸脱羧产生1,5-戊二胺。在此基础上，本发明还提供了利用本发明的赖氨酸脱羧酶、表达载体或宿主细胞催化赖氨酸脱羧产生1,5-戊二胺的方法。例如，在具体的实施方式中，可通过培养包含本发明表达载体或其基因组上整合有本发明的赖氨酸脱羧酶的编码序列的宿主细胞或者利用本发明的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸产生1,5-戊二胺；然后从催化体系中获得产生的1,5-戊二胺。本发明所述的用于催化以产生1,5-戊二胺的赖氨酸，可以是宿主细胞自身产生的赖氨酸，也可以是外源添加的赖氨酸。本发明的优点：1.与现有技术中的赖氨酸脱羧酶相比，本发明的赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸产生1,5-戊二胺的活性显著提高，催化赖氨酸生产1,5-戊二胺时相同催化剂的生产强度比野生型赖氨酸脱羧酶高1.7倍以上；2.使用本发明的赖氨酸脱羧酶进行工业催化，可以有效降低催化剂用量或缩短催化反应时间，从而减少催化剂成本、固定资产投入、操作成本或提高产能，具有成本优势；和3.本发明为进一步优化赖氨酸脱羧酶，提升其稳定性，推动生物法1,5-戊二胺的工业化提供了新的思路。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。实施例1.cada野生型菌株的构建将e.colimg1655(获自atcc700926，可参考blattnerfr等,thecompletegenomesequenceofescherichiacolik-12.science277:1453-62(1997))在lb培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph7.0)中，37℃，200rpm，培养12-16h后，收集细胞，采用biomiga基因组小提试剂盒提取基因组dna。以大肠杆菌基因组为模板，以cada-f(如seqidno:3所示)和cada-r(如seqidno:4所示)为引物，扩增cada基因(序列如seqidno:2所示)，通过5‘ndei和3’xhoi克隆至载体pet-21a(+)(购自novagen公司)，获得pet21-cada表达质粒，再将其转化至e.colibl21(de3)，获得e.colibl21(de3)/pet21-cada野生型工程菌株。实施例2.cada突变菌株的获得利用stratagene系列xl-ii定点突变试剂盒，分别设计6对引物(见表1)，以已构建的pet21-cada野生型质粒为模板，分别采用6对引物进行pcr扩增，分别将cada第9位氨基酸的组氨酸突变为精氨酸，44位的赖氨酸突变为精氨酸，88位的苏氨酸突变为丝氨酸，111位的谷氨酸突变为甘氨酸，176位的蛋氨酸突变为缬氨酸，230位的酪氨酸突变为组氨酸，所得表达突变体的质粒分别命名为pet21-h9r、pet21-k44r、pet21-t88s、pet21-e111g、pet21-m176v和pet21-y230h。pcr反应条件为：95℃5min，25个循环(95℃30s，50℃30s，68℃9min)，68℃10min。pcr扩增体系(50μl)：模板1μl，上下游引物各2μl，dntpmix1μl，10×pyrobestbuffer5μl，灭菌的双蒸水38.5μl，pyrobestdna聚合酶0.5μl。采用胶回收试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)对pcr产物进行纯化和回收。转化子由金唯智公司进行测序，序列正确的质粒转化至e.colibl21(de3)，分别获得cada突变体的工程菌株e.colibl21(de3)/pet21-h9r、e.colibl21(de3)/pet21-k44r、e.colibl21(de3)/pet21-t88s、e.colibl21(de3)/pet21-e111g、e.colibl21(de3)/pet21-m176v和e.colibl21(de3)/pet21-y230h。表1.引物序列引物名称序列编号引物序列(5’-3’)h9r-fseqidno:5gcaatattgaatcgcatgggggtttatttth9r-rseqidno:6aaaataaacccccatgcgattcaatattgck44r-fseqidno:7cgaccgtgacgacttattaagactgatcgaaaacaatgck44r-rseqidno:8gcattgttttcgatcagtcttaataagtcgtcacggtcgt88s-fseqidno:9cgtattcctctctcgatgtaagcctgaatgt88s-rseqidno:10catcgagagaggaatacgtattagcgaacgce111g-fseqidno:11gcgctgggtgctgctggagatattgctaataagatce111g-rseqidno:12gatcttattagcaatatctccagcagcacccagcgcm176v-fseqidno:13gatttctttggtccgaataccgtgaaatctgatatttcm176v-rseqidno:14gaaatatcagatttcacggtattcggaccaaagaaatcy230h-fseqidno:15ctgcgaacaaaattgttggtatgcactctgctccagcy230h-rseqidno:16gctggagcagagtgcataccaacaattttgttcgcagcada-r2seqidno:17ttacgccaagcttttttttgctttcttctttcaatacc实施例3.cada野生型及突变体工程菌株的戊二胺生产工程菌株的菌体培养及赖氨酸脱羧酶的表达：各工程菌的取适量平板活化的菌苔接种于装有100ml液体lb培养基(蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％，ph7.0)的500ml种子瓶内，添加0.1g/l氨苄青霉素，在37℃、220rpm振荡培养12小时；5％转接装2l菌体发酵培养基(葡萄糖30g/l、酵母粉5g/l、氯化铵8g/l、磷酸二氢钾5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、七水合硫酸亚铁0.2g/l)的5l发酵罐中，添加0.1g/l氨苄青霉素，发酵温度为37℃，搅拌转速为300rpm-900rpm，空气流量为1-4vvm，发酵过程中用氨水溶液控制ph为7.0，流加葡萄糖控制在10g/l左右，od600生长至30时补加0.1mmiptg诱导表达赖氨酸脱羧酶3h。戊二胺生产：在5l发酵罐中进行全细胞催化，底物赖氨酸盐酸盐浓度约为450g/l，辅酶磷酸吡哆醛0.1mm，工程菌的用量约为3g/l细胞干重，控制搅拌转速为500rpm，反应温度为52℃，转化4h后，溶液中戊二胺产量，残留赖氨酸含量及最大的赖氨酸转化速率见表2所示。与野生型cada相比，h9r突变体的产量是野生型的2.80倍，单位菌体干重的最大的赖氨酸转化速率是野生型的2.90倍；k44r突变体的产量是野生型的3.04倍，单位菌体干重的最大的赖氨酸转化速率是野生型的3.74倍；t88s突变体的产量是野生型的2.27倍，单位菌体干重的最大的赖氨酸转化速率是野生型的1.99倍；m176v突变体的产量是野生型的2.89倍，单位菌体干重的最大的赖氨酸转化速率是野生型的3.86倍；y230h突变体的产量是野生型的2.54倍，单位菌体干重的最大的赖氨酸转化速率是野生型的2.43倍；e111g突变体的产量是野生型的2.85倍，单位菌体干重的最大的赖氨酸转化速率是野生型的3.20倍。同时所有突变体的赖氨酸残留量显著降低。表2.戊二胺产量及残留赖氨酸含量讨论:本发明对野生型赖氨酸脱羧酶的特定位点进行突变，得到赖氨酸脱羧酶突变体的活性显著提升，其生产1,5-戊二胺的产量是利用野生型赖氨酸脱羧酶的2.2倍以上，甚至接近三倍。现有技术中虽然公开了一些野生型赖氨酸脱羧酶的突变体，例如us2015132808专利申请公开了将88位的苏氨酸(t)突变成arg、lys和asn。但该文献公开的赖氨酸脱羧酶生产1,5-戊二胺的产量相比于野生型赖氨酸脱羧酶，仅仅提高了不到20％，甚至大部分突变体对于生产1,5-戊二胺的提高程度小于10％。此外，arg、lys和asn都为碱性氨基酸，与野生型赖氨酸脱羧酶中的苏氨酸并不属于同类氨基酸，而本发明的突变体在88位进行了同类氨基酸的替换，即苏氨酸和丝氨酸均是侧链带羟基的氨基酸，但这种同类氨酸酸的替换却生产了出乎意料的显著技术效果，产量是野生型的2.27倍，最大的赖氨酸转化速率是野生型的1.99倍。在韩国专利kr20170017341(a)中报道f14c和k44c双突变导致形成一个二硫键，不能提高酶活；但是在可以提高活性24.4％的l7m/n8g双突变体基础上再同时突变f14c和k44c形成的l7m/n8g/f14c/k44c四个突变的组合突变体活性可以提高56.7％，也就是说k44c必须在与l7m/n8g/f14c三个突变体组合才有效果。而本发明的k44r单位点突变产量是野生型的3.04倍，单位菌体干重的最大的赖氨酸转化速率是野生型的3.74倍，从而生产了出乎意料的技术效果。实施例4.表达带有his标签赖氨酸酸脱羧酶的工程菌株生产戊二胺采用实施例1相同的方法，以大肠杆菌基因组为模板，以cada-f(如seqidno:3所示)和cada-r2(如seqidno:17所示)为引物，扩增去除taa终止密码子的cada基因，通过5‘ndei和3’xhoi克隆至载体pet-21a(+)(购自novagen公司)，获得pet21-cadahis表达质粒，该质粒表达的cada在c端加上了6个his的标签，再将其转化至e.colibl21(de3)，获得e.colibl21(de3)/pet21-cadahis野生型工程菌株。再采用实施例2相同的方法和引物，以pet21-cadahis质粒为模板，分别构建m176v和y230h的突变体质粒，分别命名为pet21-m176vhis和pet21-y230hhis表达质粒，质粒由金唯智公司进行测序，序列正确的质粒转化至e.colibl21(de3)，分别获得cada突变体的工程菌株e.colibl21(de3)/pet21-m176his和e.colibl21(de3)/pet21-y230hhis。工程菌株e.colibl21(de3)/pet21-cadahis、e.colibl21(de3)/pet21-m176vhis和e.colibl21(de3)/pet21-y230hhis通过摇瓶表达酶及催化评价工程菌的性能。工程菌株的菌体培养及酶得表达如下：各工程菌取5微升甘油菌液接种于装有5ml液体lb培养基(蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％，ph7.0)的25ml黑盖瓶内，添加0.1g/l氨苄青霉素，在37℃、220rpm振荡培养12小时；2％转接装30ml液体lb培养基(蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％，ph7.0)的250ml摇瓶中，添加0.1g/l氨苄青霉素，发酵温度为37℃，搅拌转速为220rpm，od600生长至0.6时补加0.1mmiptg诱导表达4h。戊二胺生产条件如下：在250ml摇瓶中进行全细胞催化，底物赖氨酸盐酸盐浓度约为25g/l，辅酶磷酸吡哆醛0.1mm，工程菌的用量约为0.2g/l细胞干重，控制搅拌转速为220rpm，反应温度为37℃，转化4h后，溶液中戊二胺产量及残留赖氨酸含量见表3所示。与带his标签的野生型cada相比，带his标签的m176v突变体的产量是野生型的2.67倍，带his标签的y230h突变体的产量是野生型的2.00倍，同时带his标签的突变体的赖氨酸残留量显著降低。表3.戊二胺产量及残留赖氨酸含量以上结果表明，在赖氨酸脱羧酶cada的提高活性突变体基础上进行部分序列修饰，突变体依然能够保持提高活性的性能。实施例5.赖氨酸酸脱羧酶cada的组合突变及其戊二胺生产采用实施例2相同的方法及引物，在单突变体基础上逐一构建双突变及三突变体。在m176v突变体基础上分别构建m176v/t88s和m176v/y230h双突变表达质粒，命名为pet21-m176v/t88s和pet21-m176v/y230h。在m176v/y230h突变体基础上分别构建m176v/y230h/h9r、m176v/y230h/e111g和m176v/y230h/k44r三突变体，命名为pet21-m176v/y230h/h9r、pet21-m176v/y230h/e111g和pet21-m176v/y230h/k44r表达质粒。以上质粒由金唯智公司进行测序，序列正确的质粒转化至e.colibl21(de3)，获得cada突变体的工程菌株e.colibl21(de3)/pet21-m176v/t88s、e.colibl21(de3)/pet21-m176v/y230h、e.colibl21(de3)/pet21-m176v/y230h/h9r、e.colibl21(de3)/pet21-m176v/y230h/e111g和e.colibl21(de3)/pet21-m176v/y230h/k44r。所有工程菌及野生型对照采用实施例4相同的摇瓶表达酶及催化体现评价工程菌的性能，最终溶液中戊二胺产量及残留赖氨酸含量见表4所示。与野生型cada相比，m176v/t88s突变体的产量是野生型的2.3倍，m176v/y230h突变体的产量是野生型的1.7倍，m176v/y230h/h9r突变体的产量是野生型的2.3倍，m176v/y230h/e111g突变体的产量是野生型的2.7倍，m176v/y230h/k44r突变体的产量是野生型的3.3倍，同时突变体的赖氨酸残留量显著降低。表4.戊二胺产量及残留赖氨酸含量以上结果表明，与野生型相比，对赖氨酸脱羧酶cada的提高活性突变体进行组合突变所得的组合突变体也能够保持提高1.7倍以上活性的性能。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国科学院天津工业生物技术研究所<120>新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用<130>p2015-1663<160>17<170>patentinversion3.5<210>1<211>715<212>prt<213>artificialsequence<220><223>大肠杆菌来源的野生型赖氨酸脱羧酶<400>1metasnvalilealaileleuasnhismetglyvaltyrphelysglu151015gluproilearggluleuhisargalaleugluargleuasnphegln202530ilevaltyrproasnaspargaspaspleuleulysleuilegluasn354045asnalaargleucysglyvalilepheasptrpasplystyrasnleu505560gluleucysglugluileserlysmetasngluasnleuproleutyr65707580alaphealaasnthrtyrserthrleuaspvalserleuasnaspleu859095argleuglnileserphepheglutyralaleuglyalaalagluasp100105110ilealaasnlysilelysglnthrthraspglutyrileasnthrile115120125leuproproleuthrlysalaleuphelystyrvalarggluglylys130135140tyrthrphecysthrproglyhismetglyglythralapheglnlys145150155160serprovalglyserleuphetyraspphepheglyproasnthrmet165170175lysseraspileserileservalsergluleuglyserleuleuasp180185190hisserglyprohislysglualagluglntyrilealaargvalphe195200205asnalaaspargsertyrmetvalthrasnglythrserthralaasn210215220lysilevalglymettyrseralaproalaglyserthrileleuile225230235240aspargasncyshislysserleuthrhisleumetmetmetserasp245250255valthrproiletyrpheargprothrargasnalatyrglyileleu260265270glyglyileproglnserglupheglnhisalathrilealalysarg275280285vallysgluthrproasnalathrtrpprovalhisalavalilethr290295300asnserthrtyraspglyleuleutyrasnthrasppheilelyslys305310315320thrleuaspvallysserilehispheaspseralatrpvalprotyr325330335thrasnpheserproiletyrgluglylyscysglymetserglygly340345350argvalgluglylysvaliletyrgluthrglnserthrhislysleu355360365leualaalapheserglnalasermetilehisvallysglyaspval370375380asnglugluthrpheasnglualatyrmetmethisthrthrthrser385390395400prohistyrglyilevalalaserthrgluthralaalaalametmet405410415lysglyasnalaglylysargleuileasnglyserilegluargala420425430ilelysphearglysgluilelysargleuargthrgluseraspgly435440445trpphepheaspvaltrpglnproasphisileaspthrthrglucys450455460trpproleuargseraspserthrtrphisglyphelysasnileasp465470475480asngluhismettyrleuaspproilelysvalthrleuleuthrpro485490495glymetglulysaspglythrmetserasppheglyileproalaser500505510ilevalalalystyrleuaspgluhisglyilevalvalglulysthr515520525glyprotyrasnleuleupheleupheserileglyileasplysthr530535540lysalaleuserleuleuargalaleuthraspphelysargalaphe545550555560aspleuasnleuargvallysasnmetleuproserleutyrargglu565570575aspprogluphetyrgluasnmetargileglngluleualaglnasn580585590ilehislysleuilevalhishisasnleuproaspleumettyrarg595600605alaphegluvalleuprothrmetvalmetthrprotyralaalaphe610615620glnlysgluleuhisglymetthrglugluvaltyrleuaspglumet625630635640valglyargileasnalaasnmetileleuprotyrproproglyval645650655proleuvalmetproglyglumetilethrglugluserargproval660665670leuglupheleuglnmetleucysgluileglyalahistyrprogly675680685phegluthraspilehisglyalatyrargglnalaaspglyargtyr690695700thrvallysvalleulysglugluserlyslys705710715<210>2<211>2148<212>dna<213>artificialsequence<220><223>大肠杆菌来源的野生型赖氨酸脱羧酶的编码基因<400>2atgaacgttattgcaatattgaatcacatgggggtttattttaaagaagaacccatccgt60gaacttcatcgcgcgcttgaacgtctgaacttccagattgtttacccgaacgaccgtgac120gacttattaaaactgatcgaaaacaatgcgcgtctgtgcggcgttatttttgactgggat180aaatataatctcgagctgtgcgaagaaattagcaaaatgaacgagaacctgccgttgtac240gcgttcgctaatacgtattccactctcgatgtaagcctgaatgacctgcgtttacagatt300agcttctttgaatatgcgctgggtgctgctgaagatattgctaataagatcaagcagacc360actgacgaatatatcaacactattctgcctccgctgactaaagcactgtttaaatatgtt420cgtgaaggtaaatatactttctgtactcctggtcacatgggcggtactgcattccagaaa480agcccggtaggtagcctgttctatgatttctttggtccgaataccatgaaatctgatatt540tccatttcagtatctgaactgggttctctgctggatcacagtggtccacacaaagaagca600gaacagtatatcgctcgcgtctttaacgcagaccgcagctacatggtgaccaacggtact660tccactgcgaacaaaattgttggtatgtactctgctccagcaggcagcaccattctgatt720gaccgtaactgccacaaatcgctgacccacctgatgatgatgagcgatgttacgccaatc780tatttccgcccgacccgtaacgcttacggtattcttggtggtatcccacagagtgaattc840cagcacgctaccattgctaagcgcgtgaaagaaacaccaaacgcaacctggccggtacat900gctgtaattaccaactctacctatgatggtctgctgtacaacaccgacttcatcaagaaa960acactggatgtgaaatccatccactttgactccgcgtgggtgccttacaccaacttctca1020ccgatttacgaaggtaaatgcggtatgagcggtggccgtgtagaagggaaagtgatttac1080gaaacccagtccactcacaaactgctggcggcgttctctcaggcttccatgatccacgtt1140aaaggtgacgtaaacgaagaaacctttaacgaagcctacatgatgcacaccaccacttct1200ccgcactacggtatcgtggcgtccactgaaaccgctgcggcgatgatgaaaggcaatgca1260ggtaagcgtctgatcaacggttctattgaacgtgcgatcaaattccgtaaagagatcaaa1320cgtctgagaacggaatctgatggctggttctttgatgtatggcagccggatcatatcgat1380acgactgaatgctggccgctgcgttctgacagcacctggcacggcttcaaaaacatcgat1440aacgagcacatgtatcttgacccgatcaaagtcaccctgctgactccggggatggaaaaa1500gacggcaccatgagcgactttggtattccggccagcatcgtggcgaaatacctcgacgaa1560catggcatcgttgttgagaaaaccggtccgtataacctgctgttcctgttcagcatcggt1620atcgataagaccaaagcactgagcctgctgcgtgctctgactgactttaaacgtgcgttc1680gacctgaacctgcgtgtgaaaaacatgctgccgtctctgtatcgtgaagatcctgaattc1740tatgaaaacatgcgtattcaggaactggctcagaatatccacaaactgattgttcaccac1800aatctgccggatctgatgtatcgcgcatttgaagtgctgccgacgatggtaatgactccg1860tatgctgcattccagaaagagctgcacggtatgaccgaagaagtttacctcgacgaaatg1920gtaggtcgtattaacgccaatatgatccttccgtacccgccgggagttcctctggtaatg1980ccgggtgaaatgatcaccgaagaaagccgtccggttctggagttcctgcagatgctgtgt2040gaaatcggcgctcactatccgggctttgaaaccgatattcacggtgcataccgtcaggct2100gatggccgctataccgttaaggtattgaaagaagaaagcaaaaaataa2148<210>3<211>36<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>3gcatcccatatgaacgttattgcaatattgaatcac36<210>4<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>4ttacgccaagcttttttttgctttcttctttcaatacc38<210>5<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>5gcaatattgaatcgcatgggggtttatttt30<210>6<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>6aaaataaacccccatgcgattcaatattgc30<210>7<211>39<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>7cgaccgtgacgacttattaagactgatcgaaaacaatgc39<210>8<211>39<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>8gcattgttttcgatcagtcttaataagtcgtcacggtcg39<210>9<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>9cgtattcctctctcgatgtaagcctgaatg30<210>10<211>31<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>10catcgagagaggaatacgtattagcgaacgc31<210>11<211>36<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>11gcgctgggtgctgctggagatattgctaataagatc36<210>12<211>36<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>12gatcttattagcaatatctccagcagcacccagcgc36<210>13<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>13gatttctttggtccgaataccgtgaaatctgatatttc38<210>14<211>38<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>14gaaatatcagatttcacggtattcggaccaaagaaatc38<210>15<211>37<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>15ctgcgaacaaaattgttggtatgcactctgctccagc37<210>16<211>37<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>16gctggagcagagtgcataccaacaattttgttcgcag37<210>17<211>35<212>dna<213>artificialsequence<220><223>引物<400>17cgccaagcttttttttgctttcttctttcaatacc35当前第1页12