一种活性多肽SPGP‑V的制备方法与流程

本发明涉及一种新型动物来源活性多肽及其制备方法，具体涉及一种通过阳离子交换hplc以及两步反相hplc分离获得新型生物活性多肽的方法。

背景技术：

生物毒素是一种重要的生命现象，是生物界在亿万年进化过程中为了生存而形成的，是一个巨大的潜在发现新的生物活性分子的重要资源。目前国际上已经成功筛选到一些生物毒素分子用于治疗某些相关疾病或作为新型药物的设计参考。蜘蛛产生各种作用于神经系统的神经毒素，其神经毒素根据它们的化学结构分为蛋白多肽类神经毒素和多胺类神经毒素。其中蜘蛛多肽神经毒素最重要，蜘蛛多肽类神经毒素根据它们的功能和分子特征可分为两种类型:第一种是低分子量多肽类，它们能与兴奋性细胞膜上的阳离子通道相互作用；第二种是高分子量多肽类，它们与突触前膜的受体组分及增强神经介质的分泌作用密切相关。蜘蛛毒液已成为神经毒素的一个重要新来源，而且蜘蛛毒液中特异性药物和毒素分子也是我们寻找农业杀虫剂的较好模式分子。

技术实现要素：

本发明的目的旨在于提供一种从广西捕鸟蛛粗毒中制备新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽为蜘蛛抑钙肽-v（spgp-v），其氨基酸序列为：

nh2-glucysargtrptyrleuglyglycysserglnaspglyaspcyscyslys

hisleuglncyshisserasntyrglutrpcysvaltrpaspglythrpheser-oh。

所述的蜘蛛抑钙肽-v的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之间，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之间分别形成二硫键。

所述方法包括：（1）将广西捕鸟蛛粗毒干粉用双蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12000rpm离心5min,置于4℃保存。粗毒上样阳离子交换hplc进行第一步分离。采用waters650型hplc、美国pharmacia公司的hiprep^tm16/10cmff预装柱进行分离。486检测器检测，检测波长为215nm。流动相为四相洗脱系统，流速为3ml/min。洗脱液分别为a相0.1m磷酸二氢钠,b相0.1m磷酸氢二钠,c相1m氯化钠,d相双蒸水（ddh2o）。其中a液和b液用来调节洗脱液的ph值，采用氯化钠梯度洗脱。上述经阳离子交换hplc分离后收集的各洗脱峰分别上样反相hplc进行进一步纯化。（2）反相高效液相色谱分离脱盐纯化：在pharmacia公司的akta蛋白纯化系统上完成，采用大连依利特公司的c18反相制备柱。（3）第三步采用分析型vydacc18rp-hplc反相柱(218tp54,4.6×250mm)于分析型waters2690高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，996检测器检测，检测波长为280nm，流动相为含0.1%tfa的水（a）和乙腈（b），洗脱速度为1ml/min，柱温为40℃。

（2）通过上述阳离子交换hplc以及两步反相hplc共三步分离获得的spgp-v，运用质谱鉴定纯度达到98%以上，其分子量约为4111.7da，经序列测定，该多肽的一级结构由35个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，c-端未酰胺化。多肽spgp-v纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。

附图说明

图1是广西捕鸟蛛粗毒阳离子交换hplc图谱。箭头表示目的峰，纵坐标表示洗脱峰在280nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。

图2是广西捕鸟蛛粗毒目的阳离子交换峰反相hplc图谱。“*”表示目的峰，纵坐标表示各个洗脱峰在280nm下的吸收值，横坐标表示洗脱时间。

图3是spgp-v的反相hplc图谱。

图4是spgp-v的maldi-tof质谱图谱。

具体实施方式

1、实验材料和方法

1.1粗毒的获取

广西捕鸟蛛采集于广西省境内的山区，粗毒毒液采于雌性蛛种。简述如下：使蜘蛛张开螯爪伸入塑料杯中，然后用5～10v的脉冲电流刺激两螯肢基部外侧3～5s。蜘蛛感受电刺激后，即用触肢紧紧抱住杯壁，同时将螯爪有力刺向杯内壁并射出毒液。毒液收集后，放入-40℃冷冻干燥机中经真空冷冻干燥成浅黄色或白色粉末即为粗毒。

1.2粗毒的分级分离及质谱鉴定

spgp-v的分离纯化分为三步。（1）、阳离子交换柱层析。在waters650e色谱系统上进行，层析柱子采用watersp-1型阳离子交换柱（10mm×100mm）。称取10mg粗毒，溶于1ml双蒸水，并于台式高速离心机（国产）上离心10min（转速为10,000rpm），沉淀不溶物。取上清液进样,在配备有486紫外检测器的waters650e高级蛋白质纯化系统上，采用waterscm(300nm)填料，使用常压自装柱（10mm×100mm）进行阳离子交换层析。采用四元梯度洗脱：(a)0.1mol/l磷酸二氢钠；(b)0.1mol/l磷酸氢二钠；(c)1.0mol/l氯化钠；(d)双蒸水（ddh2o）。其中a液和b液用来调节洗脱液的ph值，采用氯化钠梯度洗脱。在280nm波长室温检测并收集所有被洗脱峰，找出目的峰后再进一步进行反相脱盐处理。找出目的峰后再进一步进行反相脱盐处理。脱盐纯化在waters515pump＆empower高效液相色谱工作站,2487检测器）上进行。采用分离柱为phenomenexc18柱（4.6mm×250mm）。一次进样200～300ml。先用100%ddh2o（含0.1%tfa）冲洗20min，将混在样品中的盐分洗涤干净（紫外检测吸收值为零）之后，用乙腈（含0.1%tfa）溶液进行梯度洗脱。流速为3.0ml/min，检测波长为280/215nm，柱温为室温。收集每个洗脱峰，用质谱鉴定它们所含成分的分子量，找出含有spgp-v的洗脱峰并进行冷冻干燥。最后，目的样品再在waters515pump＆empower高效液相色谱工作站,2487检测器），或者反相hplc纯化系统（waters公司，alliance2690hplc＆millennium32高效液相色谱工作站，996pda检测器上进行纯化。分离柱：为phenomenexc18柱（4.6mm×250mm）；洗脱液分别为：a液（0.1％tfa/h2o）、b液（0.1％tfa/can）,流速为1.0ml/min，检测波长为280/215nm，柱温箱温度为40℃。收集洗脱峰，并用maldi-tof质谱仪鉴定样品的纯度，目的样品的冻干粉末置于-20℃冰箱储存备用。

maldi-tof质谱分析在美国应用生物系统公司生产的voyager-de^tmstr型的maldi-tofmass(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flight)质谱仪上进行。用0.1℅tfa、50℅乙腈、50℅水混合液制备cca(α-cyano-4-hydroxyc-innamicacid)基质（5mg/ml），然后分别取1ul样品与3ulcca基质液混合，再取0.5ul混合液在质谱仪的样品盘上分别点样,室温下自然风干后测定各样品的分子量。采用反射模式，离子源加速电压为20kv，n2激光波长337nm，脉冲宽度3ns，离子延迟提取150ns，真空度4*10^-7torr。质谱信号单次扫描累加100次，正离子测定模式，质谱使用外标（混合标准样品）校正。

1.3氨基酸序列测定

氨基酸序列分析是应用edman降解原理，在perkinelmerprocise491a型气相测序仪（美国appliedbiosystem公司产品）上进行的。一般不直接使用天然毒素进行测序，而选用经碘乙酰胺烷基化修饰后的毒素肽作为测序样品，因为没有经碘乙酰胺修饰的半胱氨酸（cysteine）在214nm波长检测下没有吸收值，观察不到信号，不便于准确定位半胱氨酸在多肽中的位置，而经修饰的半胱氨酸的pth-cm-cys出峰信号明显，在线hplc检测能够确证多肽序列中半胱氨酸的位置。根据毒素分子量推测其含有氨基酸残基的数目，然后设定实际测序循环数，即1个空白循环+1个标准循环+氨基酸残基数目。

2、实验结果与分析

2.1spgp-v的分离纯化及质谱鉴定

由于广西捕鸟蛛成分非常复杂，通常采用二维色谱的方法分离纯化毒素多肽：即首先经过阳离子交换分离粗毒后，洗脱成分进一步采用反相hplc分离纯化。图1是虎纹捕鸟蛛粗毒的阳离子交换hplc图谱，在280nm波长下检测，可观察到8个非常明显的洗脱峰，其中第1个峰是目的峰。经maldi-tof质谱鉴定该峰内含有多种组分，分子量为4111.73da的组分所含丰度较低（图1）。收集此峰后，在waters515pump＆empower高效液相色谱工作站上进行脱盐处理和反相hplc分离纯化，所得图谱见图2,出现4个主峰。其中保留时间为57.2的峰含有目的组分。收集目的峰并冷冻干燥后，在alliance系统上进行再次反相hplc（见图3）。图中显示含spgp-v洗脱峰为单一峰，在c18反相制备柱中，保留时间为15.2min，通过质谱鉴定纯度达到98%以上。

2.2质谱分析

将图4所示洗脱峰用maldi-tof质谱分析表明所含组分单一。，经鉴定spgp-v的分子量分别为4111.7da。从图上看，样品很纯，说明目的肽的分离纯化是很成功的。

2.3氨基酸序列分析

spgp-v的序列测定在491-a测序仪上进行。测序之前对spgp-v进行碘乙酰胺烷基化修饰，结果表明，spgp-v是单链多肽分子，由35个氨基酸残基组成，其中包括6个cys。将该多肽经碘乙酰胺修饰后测定分子质量，修饰后的分子量比天然肽的分子量都增加了348da。由于每修饰一个半胱氨酸，则天然毒素的分子量增加58da，由此推断：spgp-v含有6个半胱氨酸，形成三对二硫键。

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<110>长沙沁才生物科技有限公司

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aspglythrpheser

3135