一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法与流程

本发明属于物种鉴定及中药材真伪鉴别技术领域。更具体地，涉及一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。

背景技术：

白僵蚕(bombyxmori)，蚕蛾科昆虫家蚕(bombyxmorilinnaeus)4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌beauveriabassiana(bals.)vuillant而致死的干燥体(国家药典委员会，2015)。白僵蚕中的白僵菌是一类寄生于昆虫的病原真菌，据ncbi最新数据报道，将白僵菌归类于：双核亚界(dikarya)、子囊菌门(ascomycota)、盘菌亚门(pezizomycotina)、粪壳菌纲(sordariomycetes)、肉座菌亚纲(hypocreonycetidae)、肉座菌目(hypocreales)、虫草菌科(cordycipitaceae)、虫草属(cordceps)。

白僵蚕作为我国传统的中药材，具有降血糖、降血脂、抗癌、抗惊厥、抗凝、抑菌、镇静催眠、美白等多种药理作用，从而使得其在临床治疗上具有重要的作用。目前农户养殖僵蚕所带来的收益是很可观的，可以作为农民致富的好途径(张伟基，2016)。然而，由于僵蚕具有重要的药理作用和良好的经济效益，使得一些商家为了获得更多利益，开始用假冒和不合格僵蚕充当合格僵蚕。目前传统的伪品僵蚕大多为用石灰水将死家蚕掺白加工而成(赵启有，1998)，也有将地蚕冒充正品僵蚕使用(胡大泽等，2003)，近年来，出现了新的伪品黑死蚕和空心僵蚕。由于伪品僵蚕的外观、显微等均与正品相似，难以应用常规方法进行有效鉴别，为了杜绝该类现象的出现，其真伪鉴别在白僵蚕质量评定工作上显得尤为重要。

目前现行的僵蚕质量鉴定方法主要包括两种，一是物理鉴定方法，包括外观鉴别和显微观察(徐国均等，1996；国家药典委员会，2015)、微量升华法(黄晓雪，2005)、sds-page(邱乙，2014)、灰色关联度分析法(李峰，2011)、紫外指纹图谱(冀宪领，2006)、红外指纹图谱(冀宪领，2007)、高效液相色谱法(王更先，2006)等方法对僵蚕药材质量进行鉴定；二是分子鉴定方法，主要是贾静(2016)等基于coi序列和its序列分别对僵蚕药材的基原物种家蚕和白僵菌进行鉴定，从而对白僵蚕的质量及品质进行鉴定。其中，分子鉴定具有更准确、操作简便等特点，应用前景更好。

目前对僵蚕中白僵菌真伪鉴定方面，一直缺少特异验证白僵菌的引物，缺乏一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有僵蚕真伪鉴定技术的缺陷和不足，完成对广东株白僵菌线粒体全基因组序列的高通量测序，比较白僵菌线粒体基因序列在地理种属上的差异，发现白僵菌的核糖体蛋白基因rps3变异明显；并基于白僵菌线粒体rps3基因序列设计引物，寻找特异扩增真菌白僵菌的引物，提供一种特异鉴定白僵菌的分子标记方法，从而快速鉴别僵蚕中白僵菌的真伪，为中药材僵蚕临床用药安全工作上提供分子技术支持。

本发明的目的是提供白僵菌的核糖体蛋白基因rps3序列。

本发明另一目的是提供一组鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪的引物组。

本发明再一目的是提供一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。

本发明的再一目的是提供一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明人在完成对广东株白僵菌线粒体全基因组测序和13个虫草科物种的线粒体全基因组生物信息学比较分析的基础上，发现白僵菌的核糖体蛋白基因rps3变异明显，并基于广东株白僵菌线粒体的rps3基因序列设计筛选得到了1对能特异检测白僵菌的引物。

一组鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪的引物组，为引物对f935和r1385，序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示。

所述引物组在鉴定验证僵蚕中白僵菌真伪中的应用，在构建快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法中的应用，以及在制备快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的试剂盒中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法，以待测中药材白僵蚕总dna为模板，利用引物组f935/r1385进行pcr扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据pcr扩增结果有无清晰的500bp目的电泳条带来判断待测中药材白僵蚕样品中是否含有白僵菌。

进一步优选地，还可继续对pcr扩增产物进行测序及数据对比，构建系统进化树，进一步确定结果。

其中，优选地，所述白僵蚕总dna的提取方法为：先将白僵蚕预处理成粉末后，进行总dna提取；所述预处理是指：用65～75％乙醇擦拭白僵蚕表面后，放于30～40℃环境中使酒精挥发，再粉碎磨粉。

具体更优选地，所述白僵蚕总dna的提取方法为：先用70％乙醇擦拭白僵蚕表面后，放于37℃环境中使酒精挥发，再用高速多功能粉碎机磨粉；然后加入液氮充分研磨，使用真菌基因组快速提取试剂盒抽提总dna，置于-20℃保存备用。

另外，优选地，所述pcr的反应体系为：2xtaqmastermix25μl，10pmol/μl的上下游引物各1μl，dna模板1μl，ddh2o2μl。

优选地，所述pcr的反应条件：94℃5min；94℃30s，44℃30s，72℃45s，25个循环；72℃10min。

一种包含有上述的引物对f935和r1385的快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的试剂盒，也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述试剂盒还可以包含有以待测中药材白僵蚕总dna为模板，利用引物组f935/r1385进行pcr扩增所需的试剂。

该试剂盒的使用方法如上所述快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。

本发明在完成对广东株白僵菌线粒体全基因组测序和13个虫草科物种的线粒体全基因组生物信息学比较分析的基础上，发现白僵菌的核糖体蛋白基因rps3变异明显，并基于广东株白僵菌线粒体全基因序列设计合成引物，最终筛选出了1对能特异检测白僵菌的引物。并利用12株地理株系白僵菌以及市售僵蚕样品进行引物有效性验证，完成了对设计引物特异性、有效性的验证，建立了高效、快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法。

本发明具有以下有益效果：

本发明基于对广东株白僵菌线粒体全基因组测序结果和13个虫草科物种的线粒体全基因组生物信息学比较分析，以及对12株不同地理株系白僵菌rps3基因进行多序列对比分析的基础上，发现不同地理株系白僵菌的rps3序列的部分位点存在碱基的替换现象，因此选择基因rps3作为白僵菌线粒体全基因组的分子标记应用于中药材僵蚕中白僵菌真伪鉴别，为僵蚕的真伪鉴别提供了理论基础。

同时，通过提取广东株白僵菌基因组总dna，构建高通量测序文库，采用lluminahiseq2500平台进行测序；denovo的方法将测序数据组装成完整的白僵菌线粒体基因组序列。基于广东株白僵菌线粒体全基因序列设计筛选出了1对能特异检测白僵菌的引物，特异性好、灵敏度高，从而为不同产地市售僵蚕中基原白僵菌真伪鉴别的提供新的分子鉴定方法。

利用本发明设计的这对特异鉴定白僵菌的引物对不同产地市售僵蚕中白僵菌真伪进行鉴别，最终通过pcr扩增、电泳、测序及数据对比，构建系统进化树，为僵蚕中白僵菌的分子鉴定提供了实验参考和理论依据，为中药材僵蚕的质量标准化和规范化提供新方法。

附图说明

图1为12株地理株系白僵菌rps3基因序列比对结果。

图2为12株地理株系白僵菌rps3基因序列比对结果。

图3为12株地理株系白僵菌rps3基因序列比对结果。

图4为广东株白僵菌线粒体基因结构图。

图5为广东株白僵菌近源物种所构建的系统进化树。

图6为基于广东株白僵菌线粒体rps3基因设计的引物组f935/r1385的pcr扩增结果。注：m为dl2000dnamarker；1：实验室保存株白僵菌b.bassiana，2：广东英德株白僵菌b.bassiana，3：广西南宁株白僵菌b.bassiana，4：广东英德株白僵菌血清型b.bassiana(serum_types)，5：广东英德株灰僵菌isariajavanica，6：曲霉aspergillusnomius，7：镰刀霉fusariumproliferatum，8：水空白对照组。

图7为基于引物组f935/r1385的12株地理株系白僵菌的pcr扩增结果。注：m：marker2000dl；1：实验室保存株，2：广西中平株，3：广西中平浪洞村株，4：广东茂名株，5：广东化州株，6：广西宜州石别株，7：广西环江株，8：广东翁源硝村株，9：广西南宁株，10：广东微生物研究所生防株，11：广东英德株，12：湖南泸溪株，13：水空白组。

图8为基于12株地理株系白僵菌rps3基因构建的系统进化树。

图9为引物组f935/r1385对不同产地僵蚕的pcr扩增结果。注：m：marker2000dl；1-41号为不同产地市售僵蚕；a、b号为水空白组。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1白僵菌特异引物设计

1、发明人基于线粒体全基因组学分析法，比较了包括白僵菌在内的13个虫草科物种的线粒体全基因组序列基因结构，找到了1个白僵菌差异蛋白编码基因rps3，该基因为编码核糖体蛋白s3的基因，核糖体蛋白s3是核糖体40s小亚基的组成蛋白，具有核糖体外功能，在dna损伤修复、基因表达调控、细胞凋亡等过程中发挥重要作用。

同时，应用clustalx1.81软件12株不同地理株系白僵菌rps3基因进行多序列对比分析，结果发现12株不同地理株系白僵菌的rps3序列的部分位点存在碱基的替换现象(12株地理株系白僵菌rps3基因序列比对结果如图1、2、3所示。图1、2、3是依次连续的)。

因此，选择基因rps3作为白僵菌线粒体全基因组的分子标记应用于中药材僵蚕中白僵菌真伪鉴别。

2、对广东株白僵菌线粒体全基因组进行测序

广东株白僵菌线粒体基因结构图如图4所示。广东株白僵菌线粒体为闭合环状结构，碱基全长为29922bp，gc比例为27.26％，含有42个编码基因(15个蛋白编码基因、25个trna、2个rrna)，不含gap区域。

具体方法如下：

s1.广东株白僵菌菌种的繁殖与分离纯化

配置pda培养基，采用划线法繁殖、分离纯化广东株白僵菌菌种；制备广东株白僵菌单菌落。

s2.提取广东株白僵菌基因组总dna

取适量白僵菌单菌落菌丝，加入液氮充分研磨，使用康为世纪真菌dna提取试剂盒按照其操作说明提取病叶总dna。

s3.构建高通量测序文库

s4.illuminahiseq2500平台测序

s5.质量检测

为保障后续分析的可靠性，对测序数据进行必要的检测和数据筛选，检测的内容包括：数据质量检测，测序数据量、测序数据质量、gc比例分布、测序正确率等；同时基于检测结果，对数据进行筛选，筛选的标准为：测序数据q20(正确率在99％以上的碱基的比例)不小于90％，q30(正确率在99.9％以上的碱基比例)不小于83％。

s6.线粒体基因组序列捕获

根据已经发布的近缘物种线粒体基因组序列，基于dna序列对比的方法，在总dna测序数据中分离测序样品的线粒体基因组序列。

s7.基因组组装与验证

根据线粒体基因组数据的overlap关系，将测序的dna序列片段，组装成完整的线粒体基因组。并通过测序质量和测序深度验证组装的正确性。

s8.基因组注释

基因组的注释先从trna开始，利用mitfi，trnascan-se(v1.21)和arwen对trna进行注释，确保trna注释的准确性；编码基因和rrna基因的注释，同时基于blastn&blastx(2.2.28+)的方法共同进行，通过对比结果确定具体的基因序列后，再将其翻译成蛋白质序列并注释以验证基因组注释是否正确。

s9.进化分析

采用raxml(v8.1.5)软件最大似然法构建系统进化树，bootstrap值为1000；采用的最优核苷酸模型是gtr+g+i，最优核苷酸模型为cprev+i+g+f。

s10.生物信息分析结果汇总

白僵菌线粒体基因组采用illuminahiseq2500平台进行高通量测序，构建pe测序文库，最终汇总测序数据。

进一步地，根据测序及数据对比，构建系统进化树，如图5所示，确定了广东株白僵菌的种属归类。

3、引物设计

基于完成的广东株白僵菌线粒体rps3基因高通量测序结果，设计了多组引物，经过初步筛选，确定了表1所示的6对引物组进一步实验。

表1基于白僵菌线粒体rps3基因设计引物及序列信息

4、引物验证

(1)建立pcr扩增体系和程序，如下所示：

表2pcr反应体系(50μl体系)

pcr反应条件：94℃5min；94℃30s，44℃30s，72℃45s，25个循环；72℃10min。

(2)pcr扩增

以表1所示的引物组进行pcr扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，引物组ⅰ，即引物组f935/r1385，能够特异性的检测白僵菌。

引物组f935/r1385的pcr扩增结果如图6所示，泳道8(水空白对照)未出现反应条带，说明pcr反应过程无污染现象，反应结果可靠，pcr扩增结果得到目的片段大小在500bp左右的电泳条带。基于广东株白僵菌线粒体rps3基因设计的引物组f935/r1385能够对白僵菌(泳道1、2、3)及白僵菌血清型(泳道4)进行扩增，而不能对灰僵菌(泳道5)、曲霉(泳道6)、镰刀霉(泳道7)等真菌进行扩增，则引物组f935/r1385可作为快速鉴别白僵菌的特异引物。

实施例212株地理株系白僵菌rps3基因的pcr扩增

1、以12株地理株系白僵菌dna为模板，利用引物组f935/r1385进行pcr扩增，进一步验证引物的有效性。

2、结果如图7所示，泳道13(水空白对照)未出现反应条带，说明pcr反应过程无污染现象，反应结果可靠。12株地理株系白僵菌的pcr扩增结果均得到了清晰的电泳条带，目的片段大小均在500bp左右。通过图7完成了对引物的有效性验证，该引物组f935/r1385可以作为鉴定白僵菌的特异引物。

3、进一步地，还可继续对扩增产物进行测序及数据对比，构建系统进化树，进一步确定结果。基于12株地理株系白僵菌rps3基因构建的系统进化树如图8所示。

实施例3基于引物组f935/r1385鉴别市售僵蚕样品中白僵菌的真伪

1、实验方法

(1)市售僵蚕总dna提取

样品预处理：用70％乙醇擦拭白僵蚕表面后，放在玻璃皿中，并于37℃烘箱中使酒精挥发，用高速多功能粉碎机磨粉，装于25ml灭菌塑料管中备用。

取适量僵蚕粉末，加入液氮充分研磨，使用购自上海生工生物工程有限公司的真菌基因组快速提取试剂盒抽提白僵菌菌丝体总dna，置于-20℃保存备用。

(2)不同产地市售僵蚕中白僵菌真伪鉴别

以中药材僵蚕全基因组dna为模板，利用引物组f935/r1385进行pcr扩增。

2、pcr扩增结果如图9所示，通过引物组f935/r1385对不同产地僵蚕的pcr扩增结果可以看出，根据有无清晰的500bp目的电泳条带，则可以判断市售产地僵蚕样品中是否含有白僵菌，从而对不同产地市售僵蚕中白僵菌的真伪进行鉴别。

3、进一步地，还可继续对扩增产物进行测序及数据对比，构建系统进化树，进一步确定结果，为僵蚕中白僵菌真伪鉴别的分子鉴定方法提供依据。

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