肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途与流程

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本发明涉及生物治疗与生物医药领域，特别涉及一种肿瘤特异性重组水蛭素及其制备方法和用途。

背景技术：

水蛭素是迄今发现的活性最强的天然凝血酶特异性抑制剂，最初从医用水蛭唾液腺中分离得到，由65～66个氨基酸组成，可直接与凝血酶以l：l(摩尔比)的方式结合形成非共价复合物，从而使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，抑制血栓的形成。天然水蛭素存在十种以上变体，主要有简称为hv1、hv2、hv3三种同源性很高的异构体(hirudinvariant)。

目前，国外已有两个重组水蛭素产品被批准上市：1.desirudin(商品名：revasc，瑞士novartis产品)，2.lepirudin(商品名：refludan，英国pharmion及美国berlexlaboratories产品)。两者结构上仅在n-端存在微小差异，desirudin为val1-val2，而lepirudin为leu1-tyr2。desirudin用于手术时深度静脉血栓(dvt)的预防与治疗，lepirudin用于肝素诱导的血小板减少性疾病患者的抗凝治疗。此外，水蛭素在防治不稳定性心绞痛、弥散性血管内凝血、脑血栓、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等方面都具有巨大的潜在临床应用价值。

在多种恶性肿瘤患者中存在着血液高凝状态，如肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。恶性肿瘤患者血液中的高凝状态，不仅能促进体内血栓形成，而且与肿瘤生长、侵袭以及转移明显相关。凝血功能变化可引起肿瘤细胞表型和活性改变，促进肿瘤细胞与血小板、内皮细胞、纤维结合蛋白(fibrinectin)以及vonwillebrandfactor(vwf)的黏附，从而使肿瘤细胞在局部增殖、浸润甚至向其他部位转移。血栓性疾病是仅次于肿瘤转移的恶性肿瘤患者第二大致死因素。对血栓形成高危肿瘤患者及早进行药物性干预，对于延长患者生存期、降低死亡率有重要意义。研究表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。重组水蛭素通过其抗凝作用，抑制纤维蛋白的形成，能防止肿瘤细胞与血纤维蛋白或血小板凝集，使nk细胞或其他细胞毒效应细胞的活性得以发挥。已证明水蛭素治疗可发挥疗效的肿瘤有纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化疗和放疗，通过促进肿瘤中的血流、改善乏氧状态而增强疗效。

动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，半致死剂量远大于治疗所需剂量，机体易接受，免疫性弱，不影响血小板、纤维蛋白原水平和血红蛋白含量，不易通过血脑脊液屏障。无论急性、亚急性的毒性试验，水蛭素对呼吸、血压、心率均不影响。水蛭素在体内无降解，以活性成分经肾脏排泄。

水蛭素作为一种高效、直接、特异的凝血酶抑制剂，具有很强的抗凝、抗血栓以及抗炎等多种药理活性。与肝素等传统的抗凝药物相比，其治疗剂量小、疗效高、不会引起过敏反应。水蛭素有抗原性，但其抗体没有害，反而延长消除半衰期，是一种少见的正效果抗体。因此水蛭素的应用将会不断得到开拓和推广，重组水蛭素将会成为新一代的抗凝、抗栓和抗肿瘤新药。但是，水蛭素又可导致凝血相关参数，如活化部分凝血活酶时间(aptt)、凝血酶时间(tt)和凝血酶原时间(pt)等明显升高，从而可能引起全身或系统性出血风险。临床上，作为一个理想的抗凝药物，在全身用药条件下，应当具有明确的抗凝、抗栓效果，但又不引起出血副作用，尤其是在以治疗肿瘤为目的的临床应用时，其理想的工作状态为靶向性的在肿瘤局部发挥抗凝、抗栓、抗肿瘤作用，从而使临床用药安全性提高。在肿瘤治疗领域，如何进一步减少水蛭素的副作用，增加其肿瘤治疗靶向性是值得探讨的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种肿瘤特异性重组水蛭素及表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞，至少能够解决上述问题之一。

本发明思想的指导原则的关键是构建水蛭素衍生物，使水蛭素抗凝活性进行肿瘤靶向性释放，即在正常条件下，该水蛭素衍生物无抗凝活性，而当位于肿瘤位置时，该水蛭素衍生物的抗凝活性才在肿瘤局部释放，营造不易形成血栓的微环境，甚至溶解已形成的微小栓子以达到抗凝、溶栓、防止肿瘤细胞转移的功能。这就克服了野生型水蛭素全身用药引起系统性出血的风险。

尿激酶型纤溶酶原激活物(upa)简称尿激酶，它是纤溶酶原的主要激活物之一。upa是一个有严格底物限制的丝氨酸蛋白酶，切除纤溶酶原中的cys-pro-gly-arg560-val1561-val-gly-cys序列，形成纤溶酶。近年来发现upa系统成分在肿瘤组织以及循环血中的高表达与多种肿瘤的病理特点、预后相关,upa是一系列肿瘤浸润和转移的有力标志，已成为肿瘤标志物的研究热点之一。upa的主要功能是参与基底膜的分解与再生，与肿瘤的转移关系密切。其受体upar能与玻连蛋白结合，形成αvβ3-玻连蛋白-upar复合体。upa与upar结合后活性增强。这样在肿瘤细胞表面αvβ3处富集了大量高活性upa。

水蛭素是由65～66个氨基酸组成的单链多肽，其n末端可以与凝血酶催化活性位点结合，具有抗凝活性，c末端与凝血酶的底物识别位点结合，对凝血酶有很强的特异性亲和作用。本发明设计了一个封闭水蛭素n末端的措施，以达到降低该水蛭素衍生物的抗凝活性的目的，同时还具有肿瘤靶向寻的功能。当该水蛭素衍生物位于肿瘤微环境时，利用肿瘤微环境中富含upa酶的特点，使该水蛭素衍生物n末端被封闭的水蛭素重新回复为水蛭素原形，在肿瘤局部发挥特异性靶向抗凝作用，从而成为一类新型、安全、有效的肿瘤靶向性抗凝、抗栓、抗癌剂。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种肿瘤特异性重组水蛭素，重组水蛭素的n末端含有可被upa识别并裂解的寡肽序列，用于重组的水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、水蛭素嵌合体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。

进一步的，寡肽序列为可被upa识别并裂解的生理底物短肽，氨基酸序列为pro-gly-arg-val-val，即pgrvv；

或者，寡肽序列为可被upa识别并裂解的人工优化的短肽，其结构特征为xnrvv，xn代表任意数量的任意氨基酸。

进一步的，重组水蛭素是在水蛭素异构体hv1的n末端修饰有寡肽pgr，同水蛭素异构体hv1的n端序列vv共同组成upa识别并裂解的生理底物肽序列pgrvv，重组水蛭素氨基酸序列为：seqidno.1，基因序列为：seqidno.2；

或者，重组水蛭素是将野生型水蛭素hv1肽链的c端序列替换为野生型水蛭素hv3肽链的c端序列，再在其n末端修饰pgr寡肽，重组水蛭素氨基酸序列为：seqidno.7，基因序列为：seqidno.8；

或者，重组水蛭素是人白蛋白与n末端氨基酸是vv的水蛭素异构体hv1通过寡肽pgr连接而成的融合蛋白hph，融合蛋白hph的氨基酸序列为：seqidno.11，基因序列为：seqidno.12；

或者，重组水蛭素是人嵌合免疫球蛋白fc段与n末端氨基酸是vv的水蛭素异构体hv1通过寡肽pgr连接而成的融合蛋白fph，人嵌合免疫球蛋白fc段包含人igg4铰链区、fc段序列和igm尾片序列，fph氨基酸序列为：seqidno.13，基因序列为：seqidno.14。

肿瘤细胞能够营造肿瘤微环境，通过分析肿瘤微环境的特点，可以找到肿瘤靶向性的靶标。研究表明αvβ3在多种肿瘤细胞如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤及浸润性黑色素瘤等表面高表达。在肿瘤组织新生血管内皮细胞中强烈表达，在成熟的血管内皮细胞和绝大多数正常组织中αvβ3的表达水平很低。在肿瘤组织中，肿瘤细胞分泌的生长因子使上皮细胞活化，其中整合素αvβ3的表达水平很高，这使得αvβ3成为肿瘤靶向治疗的一个理想位点。与正常组织血管系统相比，肿瘤组织大量表达αvβ3，αvβ3在肿瘤组织新生毛细血管系统中的表达水平比正常组织高出很多。整合素αvβ3能识别细胞外基质蛋白，与其特异性结合，介导肿瘤细胞的粘附与迁移，在肿瘤的生长、浸润、转移尤其是血管生成中发挥重要作用。αvβ3能够与多种含有rgd序列的蛋白结合，例如玻璃体结合蛋白、纤维结合蛋白、纤维蛋白素原、凝血酶敏感素及一些模拟rgd序列的内源性蛋白。一些设计的抗体或小分子量的αvβ3拮抗剂，在体内模型中能抑制血管内皮细胞与玻璃体结合蛋白之间的粘附，肿瘤的血管发生明显减少。

在以往研究中，rgd序列常被作为靶向药物的载体，将药物靶向到表达整合素αvβ3的肿瘤血管系统去。rgd序列是作为纤维结合蛋白与细胞的结合位点被发现的，其基本识别位点由arg-gly-asp三个氨基酸组成。在rgd衍生物中，c(rgdfk)常被作为药物的载体，因为赖氨酸残基k是最理想的能够同其他化学物质发生偶联反应的基团。人们运用噬菌体技术发现了另外一种能和αvβ3特异性结合的rgd配体：含两个二硫键的rgd序列(acdcrgdcfcg)，人们称其为rgd4c。其结合能力是含一个二硫键rgd序列的20倍，是通常线性rgd序列的200倍。rgd4c的缺点是能够形成不同的环状结构，如果形成了附加的单环和二环结构，则其结合能力降低10倍。二者相比，c(rgdfk)稳定性较好而且容易与其他化学基团发生偶联，更适合作为化学偶联的载体。而rgd4c则适合作为运用重组技术设计的靶向药物载体。

因此，重组水蛭素的n末端还连接有用于靶向整合素αvβ3的多肽，该多肽包含rgd序列。则可使上述重组水蛭素更好的靶向肿瘤微环境的整合素αvβ3。当rgd导向载体与肿瘤细胞表面αvβ3结合后，通过upa蛋白酶将水蛭素酶切释放出来，发挥抗凝、抗栓和抗肿瘤作用。

进一步的，重组水蛭素是靶向整合素αvβ3的多肽rgd4c与n末端氨基酸是vv的水蛭素异构体hv1通过linker和寡肽pgr连接而成的融合蛋白rph，融合蛋白rph的氨基酸序列为：seqidno.9，基因序列为：seqidno.10。

目前已经了解，水蛭素分子的n末端是其核心部分，含三对二硫键(cys6-cys14，cys16-cys28，cys32-cys39)，使n末端肽链绕迭成密集形核心环肽结构，与凝血酶的催化活性位点结合；而c末端为一无规则伸展的链状结构，其中gln49～gly54有空间和疏水作用，而asp55～pro60富含酸性氨基酸，带有负电荷，易与凝血酶碱性的底物识别位点结合。hv1/hv2的ser32-asp33-gly34-glu35(sdge)或hv3的ser32-asn33-gly34-lys35(sngk)为一突出于β-折叠间的loop结构，构象自由，对活性无明显作用。根据水蛭素的以上特性，将野生型水蛭素(hv1)肽链的ser32-asp33-gly34-glu35(sdge)替换为arg32-gly33-asp34-ser35(rgds)或者arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)。rgd序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，可与整合素αvβ3特异性结合。经过rgds或rgdm修饰的重组水蛭素可以更好的靶向肿瘤微环境的整合素αvβ3，通过upa蛋白酶将水蛭素酶切释放出来，发挥抗凝、抗栓和抗肿瘤作用。

进一步的，重组水蛭素是将野生型水蛭素hv1肽链的ser32-asn33-gly34-glu35替换为arg32-gly33-asp34-ser35，再在其n末端修饰pgr寡肽，重组水蛭素氨基酸序列为：seqidno.3，基因序列为：seqidno.4；

或者，重组水蛭素是将野生型水蛭素hv1肽链的ser32-asn33-gly34-glu35替换为arg32-gly33-asp34-met35，再在其n末端修饰pgr寡肽，重组水蛭素氨基酸序列为：seqidno.5，基因序列为：seqidno.6。

相应地，本发明还提供了肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法，包括以下步骤：化学合成上述的肿瘤特异性重组水蛭素基因片段，在其n末端连接信号肽，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将重组编码基因插入基因载体中制备重组载体，用该重组载体转化或转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从中回收和纯化该肿瘤特异性重组水蛭素，宿主细胞为大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

相应地，本发明还提供了上述肿瘤特异性重组水蛭素在制备抗凝、抗血栓、防治肿瘤的药物中的应用，尤其是防治肿瘤伴发高凝状态和血栓性病变的药物、保健品和功能性食品中的应用。

相应地，本发明还提供了表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，体外培养人源免疫细胞，将人源分泌型信号肽编码基因与上述的肿瘤特异性重组水蛭素的编码基因相连，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将编码基因插入载体中制备成重组基因载体，转染免疫细胞，获得表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞。

进一步的，人源分泌型信号肽为人酰胺化酶信号肽，其氨基酸序列为：seqidno.15，基因序列为seqidno.16。

进一步的，免疫细胞为αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的一种或多种，免疫细胞为人源免疫细胞。

进一步的，过继免疫细胞的膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面。

进一步的，靶标分子为cd19的全长或其截短片段，或cd20的全长或其截短片段。

进一步的，靶标分子及跨膜段的结构为：gm-csfr信号肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段。其氨基酸序列为：seqidno.17，基因序列为seqidno.18。

以过继免疫细胞为载体，在肿瘤患者体内持续稳定表达肿瘤特异性重组水蛭素，发挥“微型细胞药厂”的作用，既将细胞过继免疫治疗技术与肿瘤靶向性重组水蛭素的防栓抗癌功能整合，更好的发挥抗肿瘤作用，又可通过在体内长期稳定表达肿瘤特异性重组水蛭素，避免反复注射肿瘤特异性重组水蛭素引起潜在的过敏反应。

相应地，本发明还提供了上述表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞的应用，用于抗凝、抗血栓、防治肿瘤的生物治疗，尤其是防治伴有高凝状态和/或血栓的肿瘤患者的生物治疗。

本发明的有益效果为：本发明的肿瘤特异性重组水蛭素的n末端含有可被upa识别并裂解的短肽序列，可以封闭水蛭素n末端的凝血酶催化活性位点，以达到降低该水蛭素衍生物的抗凝活性、减少出血副作用的目的，同时还具有肿瘤靶向寻的功能，当该水蛭素衍生物位于肿瘤微环境使时，利用肿瘤微环境中富含upa酶的特点，特异性切除该水蛭素衍生物n末端的封闭肽，使被封闭的水蛭素重新回复为水蛭素原形，在肿瘤局部发挥特异性抗凝作用，从而成为一类新型、安全、有效的肿瘤靶向性抗凝、抗栓和抗癌剂。本发明更进一步的提供了表达肿瘤特异性重组水蛭素的免疫细胞，通过以过继免疫细胞为载体，在体内持续表达肿瘤特异性重组水蛭素，可解决水蛭素半衰期短的弊端，无需短时间内反复给药，可避免反复给药引起过敏或诱导抗体产生，更加适合需要长期抗凝、抗栓的肿瘤患者。表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞可靶向肿瘤局部表达，改善肿瘤患者高凝状态，溶解微血栓，防止肿瘤转移，促进免疫细胞进入肿瘤内部发挥杀伤功能，可单独应用或临床配合化/放疗使用。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

本发明的肿瘤特异性重组水蛭素的n末端含有可被upa识别并裂解的寡肽序列，upa为肿瘤组织高表达的尿激酶型纤溶酶原激活物，用于重组的水蛭素为水蛭素异构体、水蛭素突变体、水蛭素嵌合体、截短的水蛭肽、基因修饰的水蛭素或水蛭素融合蛋白。

天然水蛭素有多种异构体，其中三种主要异构体分别为hirudinvariant1(hv1)、hirudinvariant2(hv2)、hirudinvariant3(hv3)。

hv1的氨基末端的两个氨基酸为vv，upa的生理底物序列为pgrvv，酶切后断裂点位为pgr↓vv。

在hv1的n末端连接上pgr短肽，或sgr、gsgr、ggsgr等具有同等功效的短肽，与hv1的n末端的两个vv共同组成upa的底物序列pgrvv，当被upa自r和v之间裂解后，可完整释放水蛭素的抗凝活性。

进一步的，寡肽序列为可被upa识别并裂解的生理底物短肽，氨基酸序列为pgrvv；

或者，寡肽序列为可被upa识别并裂解的人工优化的短肽，其结构特征为xnrvv，xn代表任意数量的任意氨基酸。

进一步的，重组肿瘤特异性水蛭素的n末端还连接有用于靶向整合素αvβ3的多肽，该多肽包含rgd序列。则可使上述水蛭素衍生物更好的靶向肿瘤微环境的整合素αvβ3。具体的rgd序列为rgd4c序列。当rgd4c导向载体与肿瘤细胞表面αvβ3结合后，通过upa将水蛭素原形释放出来，发挥抗凝、抗栓和抗肿瘤作用。

相应地，本发明还提供了上述肿瘤特异性重组水蛭素的制备方法，包括以下步骤：化学合成上述的肿瘤特异性重组水蛭素基因片段，在其n末端连接信号肽，并在重组编码基因的两端添加限制性酶切位点，将重组编码基因插入基因载体中制备重组载体，用该重组载体转化或转染宿主细胞，培养宿主细胞，并从中回收和纯化该肿瘤特异性重组水蛭素，宿主细胞为大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

用于重组的载体优选的为真核表达载体，优选的为ppic9k。宿主细胞优选的为甲醇营养型酵母菌株gs115。

相应地，本发明还提供了表达上述肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞制备方法，将人源分泌型信号肽编码基因与上述的肿瘤特异性重组水蛭素的编码基因相连，制备成重组基因载体，转染免疫细胞，获得表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞。

该过继免疫细胞的膜表面表达有靶标分子，靶标分子通过跨膜序列定位在细胞膜表面，肿瘤特异性重组水蛭素直接表达或通过偶联诱导表达系统进行诱导表达。靶标分子为cd19的全长或其截短片段，或cd20的全长或其截短片段。

相应地，本发明表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞，肿瘤特异性重组水蛭素可以组成性表达，也可以偶联诱导表达系统进行诱导表达。偶联诱导表达系统可以是四环素诱导表达系统、蜕皮激素(ecdysone)诱导表达系统、他克莫司(tacrolimus，fk506)/雷帕霉素(rapamycin)诱导系统或ru486诱导系统中的一种。免疫细胞为αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的一种或多种，免疫细胞为人源免疫细胞。

表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞还表达自杀基因/前药系统。自杀基因/前药系统为单纯疱疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊环鸟苷(hsv-tk/gcv)系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(vzv-tk/ara-m)系统、胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(cd/5fc)系统、细胞色素p450微粒体酶cyp2b1/环磷酰胺(cyp2b1/cpa)系统；细胞色素p450cyp4b1/氨基蒽(cyp4b1/2aa)系统、脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dck/ara-c)系统、乌苷-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶/6-硫黄嘌呤(gpt/6tx)系统、硝基还原酶/cb1954(ntr/cb1954)系统、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脱氧核苷(pnp/6-mep-dr)系统、胸腺嘧啶磷酸化酶/5’-脱氧-5-氟尿嘧啶(tp/5’-dfur)系统、羧基肽酶g2/cmda系统(cpg2/cmda)、羧酸酯酶/cpt-11(ce/cpt-11)系统中的一种。

上述的表达肿瘤特异性重组水蛭素的过继免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：制备编码肿瘤特异性重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体，基因载体中包括(信号肽序列-肿瘤特异性重组水蛭素序列)和(信号肽序列-靶标分子序列-linker-跨膜段序列)两段基因序列；将上述编码肿瘤特异性重组水蛭素和靶标分子的基因载体通过基因工程技术转染免疫细胞。

基因工程技术为公知技术，所用基因转染系统包括慢病毒转染系统、逆转录病毒转染系统、腺病毒转染系统、腺相关病毒转染系统、睡美人转座子转染系统、质粒电转染系统。优选的，采用睡美人转座子转染系统或电转染系统。以瞬时表达载体，将肿瘤特异性重组水蛭素基因导入过继免疫细胞，可使其外源基因表达量可控，避免过量表达的风险。

编码肿瘤特异性重组水蛭素和膜型分子靶标的基因载体的结构为：信号肽-肿瘤特异性重组水蛭素-ires-信号肽-靶标分子-linker-跨膜段，或者，信号肽-靶标分子-linker-跨膜段-p2a-信号肽-肿瘤特异性重组水蛭素。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例的重组水蛭素是在水蛭素异构体hv1的n末端修饰有寡肽pgr，同水蛭素异构体hv1的n末端序列vv(缬氨酸-缬氨酸)共同组成可被upa识别并裂解的生理底物肽序列pgrvv，重组水蛭素氨基酸序列为：seqidno.1，基因序列为：seqidno.2。

其中，pgrvv可被其它upa酶切底物肽序列替换，其共同特点为包含有rv序列，如：gsgrvv，ggsgrvv，lggsgrvv。以保证经upa酶切后，释放的水蛭素氨基末端的两个氨基酸为vv。水蛭素异构体hv1可被其它n末端为vv的水蛭素异构体替换。