Clean‑CL纯化试剂盒及其应用的制作方法

文档序号:11212259阅读:1747来源:国知局
Clean‑CL纯化试剂盒及其应用的制造方法与工艺
本发明属于生物
技术领域
,具体涉及clean-cl纯化试剂盒及其应用。
背景技术
:自从dna的双螺旋结构被人们解析开始,人们在探究健康与疾病的基因组的复杂性与差异性上做出了巨大的努力。为了支持人类基因组计划的顺利进行,人们在仪器和试剂上做出了巨大的改进。该计划的完成使得人们强烈的意识到人们需要更多更好的技术与数据分析能力来回答随之而来的一系列生物学问题。然而,通量的限制以及居高不下的测序成本成为了人们进一步了解基因组的一道坎。2000年之后推出的高通量测序平台很好地解决了这个问题,人类基因组测序的成本直接因此下降50000倍,并且由此产生了一个新的名词:下一代测序(next-generationsequencing,ngs)。在过去的十年中,ngs技术不停的在进步——测序的数据量增加了100-1000倍。这些技术上的进展使得人们甚至可以在一条read上读出整条基因组序列。根据veritasgenomics的数据,人类基因组测序的成本也已经下降到1000美元/人。不仅如此,该技术已经广泛在临床诊断上得到应用。高通量测序技术的流程大致分为基因组dna提取、文库构建、上机测序和数据解读。而其中的文库构建,以现在普遍的技术是需要进行磁珠纯化的,主要目的是去掉引物二聚体和杂质等。现有进口磁珠纯化试剂因其高昂的价格使得整体人类基因组检测成本提高。技术实现要素:本发明的一个目的是提供一种磁珠纯化试剂。本发明提供的磁珠纯化试剂是将羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles、tris-hcl溶液、edta溶液、氯化钠、聚乙二醇和水混匀得到的溶液。上述试剂中,所述羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles、所述tris-hcl溶液、所述edta溶液、所述氯化钠和所述聚乙二醇的配比为205ul:(80-120)ul:(15-25)ul:(1-1.3)g:(1.5-2.2)g。上述试剂中,所述羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles、所述tris-hcl溶液、所述edta溶液、所述氯化钠和所述聚乙二醇的配比具体为205ul:100ul:20ul:1.17g:1.8g。上述试剂中,所述聚乙二醇为聚乙二醇11000;所述tris-hcl溶液的浓度为1m;所述edta溶液的浓度为0.5m;所述水为灭菌纯化水。在本发明的具体实施例中,10ml的磁珠纯化试剂是将205ul羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles、100ultris-hcl溶液、20uledta溶液、1.17g氯化钠和1.8g聚乙二醇混匀,灭菌纯化水定容至10ml得到的。本发明的另一个目的是提供上述磁珠纯化试剂的制备方法。本发明提供的上述磁珠纯化试剂的制备方法包括如下步骤:(1)将羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles至于离心管中;向所述离心管中加入tris-hcl溶液、edta溶液和水,混匀,得到体系甲;(2)向所述体系甲中加入氯化钠和聚乙二醇,混匀,得到体系乙;(3)向所述体系乙中加入水,混匀,孵育,得到磁珠纯化试剂。上述方法中,所述羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles、所述tris-hcl溶液、所述edta溶液、所述氯化钠和所述聚乙二醇的配比为205ul:(80-120)ul:(15-25)ul:(1-1.3)g:(1.5-2.2)g;在本发明的具体实施例中,所述speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles、所述tris-hcl溶液、所述edta溶液、所述氯化钠和所述聚乙二醇的配比具体为205ul:100ul:20ul:1.17g:1.8g。上述方法中,所述聚乙二醇为聚乙二醇11000;所述tris-hcl溶液的浓度为1m;所述tris-hcl溶液的ph为8.0;所述edta溶液的浓度为0.5m;所述水为灭菌纯化水。上述方法中,所述羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles至于离心管之前还包括在室温放置的步骤;所述室温放置的时间为30分钟,且放置期间每10分钟涡旋振荡1分钟;所述混匀的方法为振荡,所述振荡的时间具体为3min;所述孵育的条件为8rpm孵育2小时。本发明还有一个目的是提供一种纯化试剂盒。本发明提供的纯化试剂盒包括上述磁珠纯化试剂或上述方法制备得到的磁珠纯化试剂。本发明的纯化试剂盒在具体的使用中,向样本(如pcr结束后的反应体系)中加入的上述磁珠纯化试剂的量为所述样本的体积(如pcr结束后的反应体系的体积)的1.8倍。本发明的最后一个目的是提供上述磁珠纯化试剂或上述方法制备得到的磁珠纯化试剂或上述纯化试剂盒的新用途。本发明提供了上述磁珠纯化试剂或上述方法制备得到的磁珠纯化试剂或上述纯化试剂盒在如下1)-4)中任一种所述的应用:1)核酸纯化;2)文库构建;3)pcr体系纯化;4)酶切和连接反应体系纯化。本发明提供了一种clean-cl纯化试剂盒。本发明的clean-cl纯化试剂盒是一款磁珠法dna产物纯化试剂盒,该纯化试剂盒中含有磁珠纯化试剂,所述磁珠纯化试剂是将羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles、tris-hcl溶液、edta溶液、氯化钠、聚乙二醇和水混匀得到的溶液,可有效结合大小为100-500bp的片段,有效去除dntp、引物、引物二聚体、接头、盐离子和其他杂质。通过实验证明:本发明的clean-cl纯化试剂盒中的磁珠纯化试剂具有良好的可用性和稳定性,可以保证建库质量,并且和现有技术中的纯化试剂盒相比,本发明的clean-cl纯化试剂盒的成本大大降低(根据市场价格:本发明的clean-cl纯化试剂盒试剂成本:328.32元/50ml;beckmanagencourtampurexp-核酸纯化试剂盒试剂成本:10281元/60ml;axygenaxypreptmmagpcrclean-upprotocol试剂成本:5694元/50ml)。因此,本发明的clean-cl纯化试剂盒解决了现有进口磁珠纯化试剂价格高昂的问题,可广泛应用于sanger和ngs文库构建、pcr体系纯化、酶切和连接反应体系纯化等。附图说明图1为安捷伦2100检测仪的文库质检结果。图2为qubite3.0核酸检测仪的文库质检结果。具体实施方式下述实施例中的试剂及其购买处如表1所示:表1、试剂及其购买处下述实施例中的耗材设备及其购买处如表2所示:表2、耗材设备名称规格型号厂家涡旋振荡器si-0246scientificindustries旋转混合器ptr-35grant-bio量筒20ml成都特斯特移液器1mleppendorf移液器200uleppendorf移液器100uleppendorf电子天平bsa423ssartorius离心管15mlfalcon实施例1、clean-cl纯化试剂盒及其使用方法一、clean-cl纯化试剂盒本发明的clean-cl纯化试剂盒包括clean-cl磁珠纯化试剂,clean-cl磁珠纯化试剂由羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles、1mtris-hcl溶液(ph8.0)、0.5medta溶液、氯化钠、聚乙二醇11000和无菌纯化水配置而成。10ml试剂量的clean-cl磁珠纯化试剂中各组分的用量如表3所示。具体配置方法如下:表3、10ml试剂量的clean-cl磁珠纯化试剂中各组分的用量(1)取205ul的羧酸盐磁珠speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles室温放置30分钟,期间每10分钟涡旋振荡1分钟。(2)取出15ml离心管(自带刻度),将离心管盖旋下,用1ml移液器将室温放置后的speedbeadmagneticcarboxylatemodifiedparticles至于离心管中。(3)用100ul移液器吸出100ul的1mtris-hcl溶液(ph8.0)加入到上步(2)中。(4)用100ul移液器吸出20ul的0.5medta溶液加入到上步(3)中。(5)用20ml量筒称量5ml灭菌纯化水加入到上步(4)中。(6)将15ml离心管盖旋紧,打开涡旋振荡器,振荡3分钟。(7)用电子天平称量1.17g氯化钠加入到上步(6)中。(8)用电子天平称量1.8g聚乙二醇11000加入到上步(7)中。(9)将15ml离心管盖旋紧,打开涡旋振荡器,振荡3分钟。(10)用1ml移液器吸取灭菌纯化水至上步(9)中,定容至10ml。(11)将上步定容好的溶液,旋好盖子在室温下插入到旋转混合器上,将旋转混合器上调整8rpm孵育2小时,得到clean-cl磁珠纯化试剂,并将其放置到4度冰箱,保存备用。本发明的clean-cl纯化试剂盒包括如下三种规格:clean-cl-1(使用离心管)、clean-cl-96(使用96孔板)和clean-cl-384(使用384孔板),根据样本量可以选择合适的clean-cl纯化试剂盒。二、clean-cl纯化试剂盒的使用方法采用clean-cl纯化试剂盒对pcr结束后的反应体系进行纯化,具体使用方法如下(以单一样本采用1.5ml离心管为例):1、将试剂盒中的clean-cl磁珠纯化试剂从4度保存中拿至室温平衡30分钟。2、向样本(pcr结束后的反应体系)中加入适量的clean-cl磁珠纯化试剂(加入clean-cl磁珠纯化试剂的体积为1.8×pcr反应体积)。3、在离心管中用移液器缓慢吸打至溶液完全混匀。4、盖上管盖,室温放置5分钟5、将离心管放置到1.5ml磁力架上,室温放置5分钟(5分钟后磁珠会贴服在有磁力的管壁旁,dna将吸附在磁珠上)。6、从上步管中吸取上清液,去除上清液(不要碰到磁珠),尽可能吸取干净,室温干燥2分钟。7、向上步6的管中加入配置好的80%乙醇200ul。8、用移液器轻轻吸打混匀上步7含80%乙醇的磁珠。9、盖上管盖,室温放置5分钟。10、将离心管放置到1.5ml磁力架上,室温放置5分钟。11、从上步管中吸取上清液,去除上清液(不要碰到磁珠),尽可能吸取干净,室温干燥2分钟。12、重复7-11步。13、向管中加入所需体积的无菌灭菌水,用移液器吸打混匀。14、室温放置5分钟,转移到磁力架上室温放置5分钟。15、吸取上步14中的上清液至新的离心管中。16、后续进行其他实验安排。实施例2、clean-cl纯化试剂盒的应用以16份静脉血液样本为实验材料,采用bioo文库构建试剂盒和实施例1中的clean-cl纯化试剂盒批量构建文库,检测本发明clean-cl纯化试剂盒中clean-cl磁珠纯化试剂的稳定性。同时以beckmanagencourtampurexp-核酸纯化试剂盒和axygenaxypreptmmagpcrclean-upprotocol试剂盒作为对照,构建平行文库横向比较本发明的clean-cl纯化试剂盒与beckmanagencourtampurexp-核酸纯化试剂盒和axygenaxypreptmmagpcrclean-upprotocol的差异性。建库测试过程中的反应条件、反应试剂及磁珠用量等均一致,只有纯化所用磁珠种类有差异。具体步骤如下:(一)试验前准备1、环境要求实验室事先经紫外线照射过夜,实验开始前用75%乙醇擦拭台面。实验过程中不要随意解除非实验物品并尽量减少走动。2、试验器具用75%乙醇擦拭实验台面、移液器、ep管架和磁力架。(二)试验设备及试剂耗材1、主要使用设备耗材试验主要使用设备耗材及厂家如表4所示。表4、主要使用设备耗材设备名称规格厂家pcr仪4484073abi片段检测仪2100安捷伦核酸定量仪qubit3.0life涡旋振荡器si-0246scientificindustries旋转混合器ptr-35grant-bio移液器1mleppendorf移液器200uleppendorf移液器100uleppendorf移液器10uleppendorf磁力架1.5ml-16孔life2、试验主要试剂试验主要试剂及厂家如表5所示。表5、试验主要试剂及厂家试剂名称厂家nextflexrapiddna-seqkitbiooampurexpbeckmanaxypreptmmagpcrclean-upprotocolaxygenclean-cl实施例1中的clean-cl纯化试剂盒highsensitivitydnareagents安捷伦(三)实验操作1、试剂盒室温平衡将本发明的clean-cl纯化试剂盒、ampurexp和axypreptmmagpcrclean-upprotocol三个磁珠试剂盒中的磁珠纯化试剂至于室温,放置30min。2、对纯化样本进行1:1磁珠孵育结合(1)分别吸取3ng16份静脉血液样本的cfdna(使用<天跟游离dna提取试剂盒提取>)至新的pcr管,补足至32ul水,然后加入15ulnextflexend-repair&adenylationbuffermix(bioorapiddna-seqkit,货号:5144-08)和3ulnextflexend-repair&adenylationenzymemix(bioorapiddna-seqkit,货号:5144-08),混匀10次,得到50ul的反应体系;然后将50ul的反应体系进行孵育,如果是pcr仪孵育,则先22℃孵育20min,然后再72℃孵育20min。(2)连接接头充分混匀nextflexligaseenzymemix(bioorapiddna-seqkit,货号:5144-08),避免分层,然后在pcr仪或水浴锅中预热至22℃;在冰上向每管的50ul的反应体系中再加入47.5ul的nextflexligaseenzymemix和2.5ul的nextflexdnabarcode(bioorapiddna-seqkit,货号:5144-08),得到100ul的反应体系;将100ul的反应体系进行孵育,如果是pcr仪孵育,则22℃孵育15min;如果是水浴锅孵育,则22℃孵育17min。(3)磁珠纯化向步骤(2)获得的100ul的反应体系分别加入180ul充分混匀的clean-cl纯化试剂盒、beckmanagencourtampurexp-核酸纯化试剂盒和axygenaxypreptmmagpcrclean-upprotocol中的磁珠纯化试剂,轻轻吹打均匀,室温孵育15min;然后室温放置磁力架至少5min,使磁珠充分吸附在磁力架上,吸弃上清,收集沉淀,并将含有沉淀的反应管置于磁力架上用80%乙醇的进行洗杂,洗杂的具体步骤如下:1)向置于磁力架上的反应管中加入200ul80%的乙醇溶液;2)室温孵育30s,吸弃上清;3)重复步骤1)和2);4)室温静置15min以晾干磁珠;5)每管加入52.5ulrsb(resuspensionbuffer),充分混匀磁珠;6)室温孵育2min,然后磁力架静置5min;7)吸取50ul上清至一新的ep管;8)每管分别加入50ul充分混匀的clean-cl纯化试剂盒、beckmanagencourtampurexp-核酸纯化试剂盒和axygenaxypreptmmagpcrclean-upprotocol中的磁珠,轻轻吹打均匀,室温孵育15min;9)然后室温放置磁力架至少5min,使磁珠充分吸附在磁力架上;10)吸弃上清;11)然后向置于磁力架上的反应管中加入200ul80%的乙醇溶液;12)室温孵育30s,吸弃上清;13)重复步骤11)和12);14)室温静置15min以晾干磁珠;15)每管加入22.5ulrsb(resuspensionbuffer),充分混匀磁珠;16)室温孵育2min,然后磁力架静置5min;17)吸取20ul上清至一新的pcr管。(4)富集dna片段每管加入2ulnextflexprimermix(bioorapiddna-seqkit,货号:5144-08),再加入12ulnextflexpcrmastermix(bioorapiddna-seqkit,货号:5144-08),补水16ul,将体系调整到50ul,充分混匀,进行pcr扩增,得到pcr扩增产物。pcr扩增程序如下:98℃2min;98℃30s,65℃30s,72℃60s,12个循环;72℃5min,4℃hold。(5)磁珠纯化向步骤(4)获得的pcr扩增产物中分别加入50ul充分混匀的clean-cl纯化试剂盒、beckmanagencourtampurexp-核酸纯化试剂盒和axygenaxypreptmmagpcrclean-upprotocol中的磁珠纯化试剂,轻轻吹打均匀,室温孵育15min;然后室温放置磁力架至少5min,使磁珠充分吸附在磁力架上,吸弃上清,收集沉淀,并将含有沉淀的反应管置于磁力架上用80%的乙醇溶液进行洗杂,洗杂的具体步骤如下:1)向置于磁力架上的反应管中加入200ul80%的乙醇溶液;2)室温孵育30s,吸弃上清;3)重复步骤1)和2);4)室温静置15min以晾干磁珠;5)每管加入52.5ulrsb(resuspensionbuffer),充分混匀磁珠;6)室温孵育2min,然后磁力架静置5min;7)吸取50ul上清至一新的ep管;8)每管再加入50ul充分混匀的clean-cl纯化试剂盒、beckmanagencourtampurexp-核酸纯化试剂盒和axygenaxypreptmmagpcrclean-upprotocol中的磁珠,轻轻吹打均匀,室温孵育15min;9)然后室温放置磁力架至少5min,使磁珠充分吸附在磁力架上;10)吸弃上清;11)然后向置于磁力架上的反应管中加入200ul80%的乙醇溶液;12)室温孵育30s,吸弃上清;13)重复步骤11)和12);14)室温静置15min以晾干磁珠;15)每管加入22.5ulrsb(resuspensionbuffer),充分混匀磁珠;16)室温孵育2min,然后磁力架静置5min;17)吸取20ul上清至一新的pcr管。(四)文库质控分别进行安捷伦2100检测仪及qubite3.0核酸检测仪进行文库质检。安捷伦2100质检说明(以下操作所用试剂均为<安捷伦highsensitivitydnareagents>)经安捷伦2100进行文库质检。具体步骤如下:1、准备凝胶染料混合液gel-dyemix(1)取出agilenthighsensitivitydnareagents试剂盒中的dna浓缩染料(蓝色)和dna凝胶(红色),平衡试剂到室温。大约30min。(2)涡旋dna浓缩染料(蓝色),然后用移液器吸取25ul染料,添加到一管dna凝胶中(红色)。(3)充分涡旋混合液,离心。转移到过滤柱中。(4)加载凝胶染料混合液gel-dyemix。(5)取一块新的dna芯片,放在芯片注胶平台上。(6)吸取9ul凝胶染料混合液加到标记有g的孔内。(7)确保注射器柱塞定位在1ml然后关闭芯片注胶平台。(8)按压柱塞,直到被夹子卡住。(9)等待计时60s,然后松开夹子。(10)等待5s,然后拉回柱塞到1ml的位置。(11)打开芯片注胶平台,吸取9ul凝胶染料混合液加到其他标记有g的孔内。2、加载标记物markers吸取5ulmarker(绿色)加到12个样品孔内和ladder孔内,不要让任何孔空着。3、加ladder和加样(1)吸取1uldnaladder(黄色)到标记有梯子的孔内。(2)其他12个样品孔内,需要使用的孔内添加1ul样品,不需要使用的孔内,添加1ul去离子水。(3)将芯片水平的放在芯片涡旋振荡器上,2400rpm涡旋1min(计时器计时)。(4)5min之内芯片必须放在agilent2100上,按照软件提示进行dna电泳操作。4、上机(1)双击桌面上agilent2100的软件图标,进入系统。(2)在实验开始之前,先将清洗电极用的cleanerchip注满超纯水,放在芯片平台上,盖上仪器的盖子,清洗15s左右,打开仪器盖子,取出cleanerchip。将之前加完样本的芯片放在仪器芯片平台上,盖上仪器的盖子,按照软件提示点击软件上的start按钮,进行dna电泳操作。qubite3.0核酸检测仪进行文库质检的步骤如下:1、试剂配置(1)取出qubitreagent(hs)1ul加入199ulqubitbuffer,振荡混均,备用。(2)吸取1ul文库样本,加入到上步备用配置液中,振荡混均。2、上机检测将上步混合有配置液的样本盖紧盖子,放在qubit3.0检测仪器上,点击开始检测。质检结果如表6、图1和图2所示。结果表明:三个磁珠试剂盒经安捷伦2100检测片段大小均无明显差别(检测目的片段区间为:280-300bp);文库浓度经过qubit3.0检测仪检测浓度均为合格值(检测浓度≥2ng/ul)。同一样本建平行文库的出库浓度值比较均一,显示片段大小也趋于一致,说明本发明的clean-cl磁珠纯化试剂与xp磁珠和axygen磁珠建库的效果趋于一致。本发明的clean-cl磁珠纯化试剂批量构建nipt文库,从出库浓度和片段值可以看出,建库效果比较稳定,可有效去除dntp、引物、引物二聚体、接头、盐离子和其他杂质,应用于sanger和ngs文库构建、pcr体系纯化、酶切和连接反应体系纯化等。而且相对于现有技术中的纯化试剂盒,本发明的clean-cl纯化试剂盒中的clean-cl磁珠纯化试剂的成本低,可以大大降低建库成本。表6、质检结果注:xp=beckmanagencourtampurexp-核酸纯化试剂盒;axygen=axygenaxypreptmmagpcrclean-upprotocol;自配磁珠=clean-cl磁珠纯化试剂。当前第1页12
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