本发明涉及一种菌核曲霉及其制备青霉酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
青霉酸主要是曲霉菌(a.sclerotiorum,a.ostianus,a.terreus,a.ochraceus)和青霉菌(p.melinii,p.brasilianum,p.puberulum,p.cyclopium)的次级代谢产物，具有广泛的生物活性。
青霉酸对多株肿瘤细胞具有较强的抗肿瘤活性，对人乳腺癌高转移细胞(mda-mb-435)和人肝腹水腺癌细胞(hct-8)的ic50分别为4.43和8.76μg/ml(chem.&biodiv.2012,9(10),2203-2209)；对人大细胞肺癌细胞(nci-h460)、人乳腺癌(mcf-7)、人神经癌细胞(sf-268)、胰腺癌(miapaca-2)和人胚肺细胞(wi-38)的ic50分别为5.80、12.80、20.00、8.00和57.50μm(j.nat.prod.2004,67,1985-1991)；对小鼠骨肉瘤细胞株(pos1)的ic50为7.8μm(j.nat.prod.2013,76,297-301)；对人胃癌细胞(mkn45)、结肠癌细胞(lovo)、人肺腺癌细胞系(a549)、人乳腺癌高转移细胞(mda-mb-435)、人肝癌细胞(hepg2)和人急性早幼粒白血病细胞(hl-60)的ic50分别为2.85、2.21、7.46、6.28、3.67和0.80μg/ml(appl.microbiol.biotechnol.2013,97(17),7617-7625)。
青霉酸还具有较强的抑菌作用，对嗜水气单胞菌(aeromonashydrophilia)、鳗弧菌(vibrioanguillarum)和哈氏弧菌(vibrioharveyi)的最小抑菌浓度(mic)分别为：1.0、32和0.5mg/ml(phytochem.lett.2015,12,232-236)；对金黄色酿脓葡萄球菌(staphylococcusaureus)和大肠杆菌(escherichiacoli)的最小抑菌浓度均为128g/ml(phytochem.2017,137,165-173)。
青霉酸具有抗疟疾的活性，其ic50为16.8μm(phytochem.2017,137,165-173)。青霉酸具有很强的除草(japanpatent08-053310，1996)和调节植物生长的活性(phytochem.2005,66,1012-1016)。
申请人在研究菌核曲霉(a.sclerotiorum)jh42的液态摇床发酵产物的过程中发现该菌可以大量产生青霉酸，可规模化生产，对青霉酸在医药和工农业生产中的开发、研究和应用具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高产青霉酸的菌核曲霉，及其制备青霉酸的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种菌核曲霉，分类命名为(aspergillussclerotiorum)，株号为jh42，已于2017年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为cgmccno.13562，18srrna序列如序列表所述。
菌核曲霉是从山东省沾化县套尔河东沙子岛附近盐碱地土壤样品中分离、纯化获取得到，其获取方法包括以下具体步骤：
⑴.将盐碱地土壤样品与无菌陈海水按照质量比1:5混合，充分搅拌；
⑵.取0.5ml上述混合物均匀涂布在pda培养基中，后放于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后根据菌株的形态特征进行挑选，即得菌核曲霉菌株，并命名为jh42。
菌核曲霉制备青霉酸的方法，菌核曲霉jh42经发酵得到含有青霉酸的发酵物，发酵物经提取纯化得到青霉酸。
菌核曲霉制备青霉酸的方法，包括如下具体步骤：
⑴.将菌核曲霉jh42种到pda培养基上，在28℃培养箱中培养7天，得到种子；
⑵.将步骤⑴制备的种子接种到液体发酵培养基中扩大培养，得到发酵物；
⑶.发酵物经分离得到发酵液和菌丝体，将发酵液经萃取剂萃取，菌丝体用浸提剂浸提，后减压浓缩至不含浸提剂，再用萃取剂萃取；
⑷.发酵液萃取液和菌丝体萃取液合并，减压浓缩操作得浸膏；
⑸.将步骤⑷所得浸膏进行重结晶，得到青霉酸晶体和母液；
⑹.将步骤⑸所得母液进行硅胶柱层析分离，先用体积比为1:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脱剂进行洗脱，再用体积比为2:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脱剂进行洗脱，并收集最终的洗脱液；
⑺.将步骤⑹中所得洗脱液进行重结晶，得到青霉酸。
制备青霉酸过程中，所述pda培养基的配制方法为：200g去皮土豆切丁后用海水煮20分钟，纱布过滤得浸汁，于浸汁中添加20g葡萄糖和18g琼脂，并用海水定容至1l，在121℃高温高压下蒸汽灭菌30min。
所述发酵培养基的配制方法为：50-1000g去皮土豆切丁后用海水煮20分钟，纱布过滤得浸汁，于浸汁中添加1-100g葡萄糖、1-100g麦芽糖、1-100g甘露醇、0.1-30g酵母膏、0.1-1g七水硫酸镁、0.1-2g磷酸二氢钾；所述发酵培养基为自然ph值。
优选地，所述发酵培养基的配制方法为：200g去皮土豆切丁后用海水煮20分钟，纱布过滤得浸汁，于浸汁中添加20g葡萄糖、20g麦芽糖、10g甘露醇、3g酵母膏、0.3g七水硫酸镁、0.5g磷酸二氢钾，并用海水定容至1l，在121℃高温高压下蒸汽灭菌30min。
所述步骤⑵中发酵培养条件为在20-28℃、100-170rpm转速下进行，培养时间为5-15天。
较好的，所述步骤⑵中发酵培养条件为在28℃、170rpm转速下进行，培养时间为9天。
所述萃取剂为氯仿、二氯甲烷、苯、甲苯、二甲苯、乙酸乙酯或正丁醇中的至少一种；浸提剂为丙酮、甲醇或乙醇中至少一种；重结晶溶剂为丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇或乙醇中的至少一种。
菌核曲霉制备的青霉酸，其为无色块状晶体，分子式为c8h10o4，化学式为：
该菌核曲霉制备青霉酸的方法，产率高达1.7g/l，且得到的青霉酸纯度可达99％。该制备方法操作简单、成本低廉、省时省力，便于规模化生产，对青霉酸在医药和工农业生产中的开发、研究和应用具有重要意义。
菌核曲霉于2017年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏编号为cgmccno.13562。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施方式，用来对本发明进行进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
菌核曲霉jh42菌株的获取
本发明的菌核曲霉jh42是从山东省沾化县套尔河东沙子岛附近盐碱地土壤样品中分离、纯化得到。
其分离纯化方法为：将20g土壤样品用100ml无菌陈海水稀释，充分混合后，取0.5ml混合液均匀涂布在pda培养基中，后放于28℃恒温箱中培养，待菌落长出后根据菌株形态特征进行挑选，即得菌核曲霉菌株，并命名为jh42。
所述pda培养基的配制方法为：200g去皮土豆切丁后用海水煮20分钟，纱布过滤得浸汁，于浸汁中添加20g葡萄糖、18g琼脂和0.2g链霉素，并用海水定容至1l，在121℃高温高压下蒸汽灭菌30min。
菌核曲霉jh42菌株的鉴定
将上述挑选出的菌核曲霉jh42菌株接种到pda培养基上，28℃条件下黑暗培养7d。
菌落特征如下：菌落直径43mm，质地絮状；分生孢子结构稀少，主要集中在菌落中央，淡黄色；菌落反面淡黄色。
根据常规方法提取菌核曲霉jh42菌株的dna，并利用真菌的its区的通用引物扩增其its区，将其its区的碱基序列提交genebank，其genbank基因登录号为：hq717801，通过在genbank中进行blast检索，确定该菌株为菌核曲霉jh42。其18srrna序列如序列表所述。
青霉酸的发酵生产及分离精制
⑴.将菌核曲霉jh42种到pda培养基上，在28℃培养箱中培养7天，得到种子；
⑵.将步骤⑴制备的种子接种到液体发酵培养基中摇床发酵培养，得到发酵物；
⑶.发酵物经分离得到发酵液和菌丝体，将发酵液经萃取剂萃取，菌丝体用浸提剂浸提，后减压浓缩至不含浸提剂，再用萃取剂萃取；
⑷.发酵液萃取液和菌丝体萃取液合并，减压浓缩操作得浸膏；
⑸.将步骤⑷所得浸膏进行重结晶，得到青霉酸晶体和母液；
⑹.将步骤⑸所得母液进行硅胶柱层析分离，先用体积比为1:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脱剂进行洗脱，再用体积比为2:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脱剂进行洗脱；
⑺.将步骤⑹中所得洗脱液进行重结晶，得到青霉酸。
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取菌核曲霉jh42适量，接种到pda平板培养基上，在28℃培养箱中培养7天，得到种子。
所述pda培养基的配制方法为：200g去皮土豆切丁后用海水煮20分钟，纱布过滤得浸汁，于浸汁中添加20g葡萄糖和18g琼脂，并用陈海水定容至1l，在121℃高温高压下蒸汽灭菌30min。
将制备的种子接种到装有180ml培养液的500ml锥型瓶中，培养温度28℃，转速为170rpm,摇床培养9天，得到发酵物34.5l。其中，培养液组成为：200g去皮土豆浸汁、20g葡萄糖、20g麦芽糖、10g甘露醇、3g酵母膏、0.3g七水硫酸镁、0.5g磷酸二氢钾，用陈海水定容至1l，培养基的ph值自然。
用棉布将菌丝体和发酵液分离，将菌丝体用甲醇浸提三次，减压浓缩至不含甲醇，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次；发酵液用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩后得浸膏73g。
浸膏经丙酮重结晶得到青霉酸晶体18g，去除部分青霉酸晶体后的溶液即为母液。母液经硅胶(200-300目)柱层析分离，先用体积比为1:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脱剂进行洗脱，再用体积比为2:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作洗脱剂进行洗脱，收集体积比为2:3的乙酸乙酯和石油醚混合液作为流动相洗脱下来的溶液，收集的洗脱液中含大量青霉酸，经丙酮重结晶，得到青霉酸41g。
上述所得青霉酸验证分析如下：
青霉酸为无色块状晶体，mp81-82℃；uv(meoh)λmax(logε):224(4.02)；ir(atr)νmax3255,1739,1727,1634,1446,1345,1275,1220,1183,1166,1059,1043,1012,997,953,900,802,781,747,692cm-1；hresimsm/z169.0496[m-h]-(calcdforc8h9o4,169.0501),分子式c8h10o4。
1h及13cnmr数据见下表。
综上所述，本发明菌核曲霉jh42可大量生产青霉酸。所用培养基原料易得，成本低廉，发酵周期短。
本发明菌核曲霉jh42制备青霉酸的产率高，发酵液提取物(即：浸膏)可达2.1g/l发酵液，经简单的硅胶柱层析分离，再进行重结晶操作即可获得纯度达99％的青霉酸，分离纯化后得到的青霉酸相当于1.7g/l，产率达81％。
本发明菌核曲霉jh42制备青霉酸的方法利于工业化生产，对青霉酸在医药和工农业生产中的开发研究具有重大意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>滨州医学院
<120>一种菌核曲霉及其制备青霉酸的方法
<160>1
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<212>rna
<213>菌核曲霉(aspergillussclerotiorum)
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