检测人EGFR基因21L858R点突变的智能恒温扩增引物组、检测试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于智能恒温扩增技术检测人egfr基因21l858r点突变的引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

近年来，非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)的发病率逐年增高，严重威胁着人类的健康。表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)酪氨酸激酶抑制剂改变了nsclc患者的治疗策略。egfr突变是该类药物的预测因子，在nsclc的治疗决策中起重要作用。人表皮生长因子受体(egfr)基因外显子21l858r发生突变的非小细胞肺癌患者，对酪氨酸激酶抑制剂类药物敏感，即受体酪氨酸激酶抑制剂药物对这些患者有疗效。外显子21上的l858r点突变通常是替代突变，2573位的t由g取代，导致egfr第858位框架氨基酸由亮氨酸变为精氨酸(ctg—cgg)。因此egfr外显子21l858r点突变的检测，可以为筛选靶向治疗患者提供参考；同时可用于癌症患者，特别是肺癌患者的高灵敏度早期复发监测，以及用药期间耐药性突变监测。随着分子生物学的发展，出现了众多以分子生物学技术为基础的egfr突变检测方法，如荧光定量pcr、dna探针、dna芯片、dna直接测序等，以其高效、特异等优点而受到青睐；但这些检测技术对检测人员技术水平要求高，并且这些技术需要的检测仪器昂贵、检测周期长，难以实现快速检测和临床推广的目的。所以，在临床检测和科学研究实践中均需要一种降低操作技术和费用、快速简便、容易普及、安全可靠的检测方法。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种检测人egfr基因21l858r点突变的智能恒温扩增引物组。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种检测人egfr基因21l858r点突变智能恒温扩增检测试剂盒。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种检测人egfr基因21l858r点突变的智能恒温扩增检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一方面，本发明公开了一种检测人egfr基因21l858r点突变的智能恒温扩增检测引物组，包括tp引物、fp引物、bp引物、op1引物和op2引物，其核苷酸序列分别如下所示：

tp引物：cctatcggcataggatcacagatttgggcg；

fp引物：gctgggtgcgctccttactttgcctccttc；

bp引物：aagagaaagaataccatgc；

op1引物：aaacaccgcagcatgtc；

op2引物：ctggctgacctaaagcc。

优选地，扩增反应时，tp引物、fp引物、bp引物、op1引物和op2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。

另一方面，本发明还公开了一种检测人egfr基因21l858r点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒中含有上述方案中所列的智能恒温扩增引物组。

优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒还包括以下成分的部分或者全部：(1)dna聚合酶；(2)错配结合蛋白；(3)智能恒温扩增反应液；(4)荧光显色剂；(5)阳性对照和阴性对照。

优选地，该智能恒温扩增检测试剂盒中，其引物中tp引物、fp引物、bp引物、op1引物和op2引物的摩尔比为：8：8：4：1：1。

优选地，所述dna聚合酶为bstdna聚合酶；所述错配结合蛋白为tapmuts错配结合蛋白。

优选地，所述智能恒温扩增反应液含有：28mmdntps、10％dmso、40mmtris-hcl(ph8.8)、20mmkcl、20mm(nh4)2so4、16mmmgso4，0.2％20。

优选地，阳性对照为含有检测人egfr基因外显子21l858r突变点基因片段的t载体克隆，阴性对照为不含人egfr基因外显子21l858r突变点基因片段的水或其他溶剂。更优地，阴性对照为去离子水。

优选地，所述显色剂为1/50000原液稀释的greeni。

再有，本发明还公开了一种检测人egfr基因21l858r点突变的智能恒温扩增检测方法，包括如下步骤：

(1)待检样品dna的提取；

(2)智能恒温扩增反应：将步骤(1)中提取的待检样品dna加入智能恒温扩增反应体系中，混匀后离心，并于63℃反应40min；该智能恒温扩增反应体系中含有上述方案中所述的智能恒温扩增引物组；

(3)结果判断：通过观察ese-tubescanner扩增仪的扩增曲线判断扩增结果。

优选地，所用智能恒温扩增反应的体系为：25μl反应体系中含有tp和ep引物各1.6μmol/l、bp引物0.8μmol/l、op1和op2引物各0.5μmol/l、dntp0.5mmol/l、甜菜碱0.6mol/l、(nh4)2so4mmol/l、mgcl22.5mmol/l、kcl10mmol/l、mgso42mmol/l、greeni0.5μl、ph为8.8的tris-hcl20mmol/l、0.2％20、6ubstdna聚合酶、1μgtapmuts、1μldna步骤(1)中提取的待检样品dna，用去离子水补齐到25μl。

本发明的检测人egfr基因21l858r点突变的智能恒温扩增检测方法可以通过本发明方案中的所公开的智能恒温扩增检测试剂盒得以实施，也可以采用基于本发明的原理和设计思路采用其他类似智能恒温扩增检测试剂盒得以实现。

从原理上讲，本发明以智能恒温扩增技术为依托，开发一种可快速检测出人egfr基因21l858r点突变的引物组、试剂盒和方法，智能恒温扩增法(smartamplificationprocess)是一种基于链置换酶和dna错配修复蛋白的基因突变检测体系。智能恒温扩增技术的基本原理，即获取目标序列后在等温条件下对其反复进行扩增，并通过荧光实时监测，以检测目标序列的存在。

因此，结合上述原理及本发明实施例中的技术效果可知，本发明至少包含如下有益效果：

本发明所设计的5条引物中，tp由退火序列和一段能够与目标序列互补的核苷酸序列构成，fp带有一个茎环结构，他们的退火位点分别位于目标序列的两端，可分别从两端与互补的2条dna单链退火，向对侧延伸。op1和op2的退火位点分别位于tp和fp外侧，向中间退火延伸的同时将tp和fp延伸得到的双链剥离。带有tp或fp的单链被置换下来后又可作为模板，继续上述过程，如此可形成2种关键的单链中间产物，这2种中间产物继而分别以tp和fp的特殊结构为起点，进行自身引导的dna合成。这样循环往复，在dna聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，实现目标序列的大量扩增。在此过程中，其中一条引物上结合一种杂交敏感的荧光引物，一旦与互补序列退火杂交，即可发出一定强度的荧光，然后由成本低廉的恒温扩增仪(如ese-tubescanner)进行检测。随着扩增反应的进行，荧光强度增大，当超过检测最低i值时即可确定扩增反应的实现，也即目标序列的存在。整个过程在恒温条件下30-40min即可完成。智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异，成为单核苷酸多态性检测的有力方法。这也是与其他等温扩增技术，如环介导恒温扩增、链置换扩增、核酸序列扩增、转录酶扩增、滚环扩增、解链酶扩增等相比，智能恒温扩增最为明显的优点，这些传统的恒温扩增无法识别dna片段中的突变点而难以实现基因多态性的检测，而阻碍了恒温扩增技术在基因多态性检测领域的推广。另外，智能恒温扩增技术与传统的检测基因多态性的方法，如dna芯片、限制性片段长度多态性pcr、等位基因特异性多pcr，dna测序，taqman探针、invader等相比，其主要优势在于恒温反应这一特性决定了智能恒温扩增法无需昂贵操作仪器，具有简单、快速、成本低、灵敏度高等明显优势。相比于其他检测技术，本发明技术具有快速、精确、灵敏、特异、背景低、成本低等优点，并摆脱常见核酸检测技术对温控的精准要求束缚，具有检测仪器价格低廉，检测时间短，试剂费用低，技术要求低等优点，具体而言：

(1)检测时间短：在20-40min内可实现将对基因多态性位点的检测；

(2)恒温检测，常见的突变检测技术需要变温扩增过程，因此需要较为昂贵的含有变温模块的检测仪；本技术只需在恒温条件下借助特殊的酶即可实现恒温检测，无需昂贵仪器，成本低廉；

(3)特异性强：智能恒温扩增技术具有独特的错配抑制技术，能够识别单个核苷酸的差异。首先，反应使用了5条不对称引物，当dna链与任何一条引物不匹配时，就会阻止后续的扩增反应，外反应体系中还加入了错配结合蛋白taqmuts，如果引物出现单个碱基的错配，taqmuts即结合到错配区域，使扩增反应停止。因此，此技术可克服传统恒温扩增法无法进行基因多态性检测的局限，可准确地检测基因多态性，特异性强。

附图说明

图1是本发明实施例3中采用本发明的试剂盒及方法进行的灵敏度实验结果图。

图2是本发明实施例3中采用荧光定量pcr进行的灵敏度实验结果图。

图3是本发明实施例4样本测试实验的结果图一。

图4是本发明实施例4样本测试实验的结果图二。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1智能恒温扩增检测试剂盒的建立

人egfr基因外显子21l858r点突变的智能恒温扩增检测试剂盒，包括智能恒温扩增引物组、智能恒温扩增反应液、bstdna聚合酶、错配结合蛋白tapmuts、阳性对照和阴性对照、荧光显色剂。

(1)智能恒温扩增引物设计：以人egfr基因外显子21l858r突变点为靶基因进行引物的设计。引物序列见表1。

表1引物序列表

(2)智能恒温扩增反应液含有：28mmdntps、10％dmso、40mmtris-hcl(ph8.8)、20mmkcl、20mm(nh4)2so4、16mmmgso4，0.2％20。

(3)阳性对照为含有人egfr基因外显子21l858r突变点基因片段的t载体克隆，其制备方法为：突变dna模板来源于携带egfr外显子21上l858r点突变的细胞系h1975，利用表1中的op1和op2引物(seqidno：4和seqidno：5)对模版dna进行pcr扩增反应，得到含靶基因序列的dna，回收该扩增片段，利用常规方法连接到t载体中，即为阳性对照。

(4)阴性对照为去离子水。

实施例2使用ese-quanttubescanner仪建立人egfr基因外显子21l858r点突变的检测方法：

利用实施例1的试剂盒检测人egfr基因外显子21l858r点突变的方法，包括如下步骤：

(1)待检样品dna的提取；

(2)恒温基因扩增反应：25μl反应体系中含有tp和fp引物各1.6μmol/l、bp引物0.8μmol/l、op1和op2引物各0.5μmol/l、dntp0.5mmol/l、甜菜碱0.6mol/l、(nh4)2so4mmol/l、mgcl22.5mmol/l、kcl10mmol/l、mgso42mmol/l、greeni0.5μl、ph为8.8的tris-hcl20mmol/l、0.2％20、6ubstdna聚合酶、1μgtapmuts、1μldna模板，用去离子水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的pcr管混匀后离心，并于63℃反应40min。

(3)结果判断：将反应管放置在ese-tubescanner中进行反应，观察ese-tubescanner软件判断扩增结果，如果出现“s”型曲线则为阳性，无“s”型曲线则为阴性。

实施例3本发明检测方法与荧光定量pcr法(taqman-mgb探针法)灵敏度的比较

(1)利用实施例1的试剂盒和实施例2的方法进行检测

准备样品：

含野生型egfr基因的dna，dna来源可以是血清、血浆、外周血、口腔劲膜、胸腔积液、体液或者组织等。

egfr基因外显子21l858r突变阳性dna，突变dna模板来源于携带egfr外显子21上l858r点突变的细胞系h1975细胞。

野生型dna与突变dna混合样本，其中突变体与野生型的含量比分别为50％、10％、、5％、1％、0.5％、0.25％。

利用实施例1的试剂盒和实施例2的方法进行检测，检测结果见图1。实验结果表面，本发明方法检出的灵敏度可达0.5％。

(2)荧光定量pcr法(taqman-mgb探针法)

taqman探针的序列为：

5’-vic-ttgggctggccaa-mgb-3’

5’-fam-ttgggcgggccaa-mgb-3’

5’-ccgcagcatgtcaagatcac-3’

5’-tccttctgcatggtattctttctct-3’

使用abi荧光定量pcr试剂盒进行荧光定量pcr反应。

反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性10秒；65℃退火10秒；56℃延伸45秒；共进行35个循环；10℃终止反应。

检测结果见图2，实验结果表明，在突变样本含量为1％时有检出结果，突变样本含量为0.5％时不能检出。

由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到0.5％的浓度，而荧光定量pcr法(taqman-mgb探针法)方法的灵敏度为1％，而1％或以下显示为阴性结果；经比对，本发明的试剂盒及方法灵敏度明显高于荧光定量pcr法(taqman-mgb探针法)方法的敏感度，能检测出更低含量的样品。

实施例4本发明检测方对实际血液样本的检测

(1)样本说明：取来自广州三个三家医院肿瘤科200例样本，均为非小细胞肺癌、且对酪氨酸激酶抑制剂类药物敏感的患者，其中血液样本125例，胸腔积液样本37例，组织样本38例。

(2)利用实施例1的试剂盒和实施例2的方法进行检测，具体步骤及所用试剂详见实施例1和实施例2。

(3)检测结果：

表2、样本检测实验结果

实验结果显示，200样品中126例为egfr基因外显子21l858r发生突变的阳性样本，其余为阴性样本。图3和图4是任意选取的两个阳性标的测试实验结果图。经过测序验证发现，200样品中是实际有127例为阳性样板，73例为阴性样本。除了一例组织样本为检测出阳性外，其他样本通过本发明的方案检出的结果与测序验证的结果均一一对应，因此，从检出的准确率来看，本发明的引物、试剂盒及方法准确性高于99％。另外，样本虽然来自血液、组织或者胸腔积液等不同样本获取部位，但是采用本发明的试剂盒及方法所检出的阳性样品在该类型样本中所占比例也是非常近似的，也能充分说明本发明的引物组、试剂盒及方法能够准确地应用于各种样本来源的样品的检测。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>暨南大学

<120>检测人egfr基因21l858r点突变的智能恒温扩增引物组、检测试剂盒及方法

<160>5

<210>1

<211>30

<212>人工序列

<400>1

cctatcggcataggatcacagatttgggcg

<210>2

<211>30

<212>人工序列

<400>2

gctgggtgcgctccttactttgcctccttc

<210>3

<211>19

<212>人工序列

<400>3

aagagaaagaataccatgc

<210>4

<211>17

<212>人工序列

<400>4

aaacaccgcagcatgtc

<210>5

<211>17

<212>人工序列

<400>5

ctggctgacctaaagcc