利用pH响应型木质素两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和回收纤维素酶的方法与流程

本发明涉及木质纤维素酶解技术领域，特别是涉及利用ph响应型木质素两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和回收纤维素酶的方法。

背景技术：

木质纤维素生物炼制燃料乙醇是替代汽油有效可行的技术之一。在这一炼制过程中，纤维素酶能否高效水解木质纤维素底物是关键的技术瓶颈。同时，纤维素酶因其具有活力低、耗量大和价格贵等特点，直接阻碍了纤维素乙醇的工业化。实现纤维素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途径。目前，纤维素酶回收利用技术主要有超滤膜回收、纤维素酶的固定化回收和新鲜底物重吸附法回收。

超滤膜回收可以同时回收纤维素酶中的内切酶，外切酶和β-葡萄糖苷酶，且可以得到较高纤维素酶回收效率，但是超滤膜回收存在着设备贵、超滤膜易堵塞、操作费时、成本高等问题。纤维素酶的固定化可以保持纤维素酶的稳定且利于纤维素酶的回收利用，但是固定化酶与纤维素固体颗粒之间存在很大的传质障碍，且固定化过程会严重影响酶活，因此在木质纤维素酶解体系中目前仅限于纤维二糖酶的固定化回收再用。纤维素酶具有高稳定性和对纤维素的强吸附的特性，使得酶通过新鲜底物吸附回收成为降低纤维素酶成本比例的潜在途径，但是添加新鲜底物回收纤维素酶效率较低，同时也会造成酶解体系中木质素富集，对纤维素的酶解糖化起到消极作用，且该方法无法回收纤维二糖酶。

木质素是自然界中在数量上仅次于纤维素的第二大天然高分子材料，制浆造纸工业每年都会得到5000万吨左右的木质素副产品，但超过95％的木质素仍然主要作为工业制浆的废弃物，造纸黑液的排放不仅造成资源的浪费，同时又污染环境，对其进行综合开发利用对经济的发展和环境保护都具有现实意义。纤维素乙醇工业本身也会产生大量的酶解木质素，若能将其应用于降低生物乙醇的生产成本方面将会有巨大的意义。

lou等发现低分子量高磺化度的木质素可以有效地促进纯纤维素的酶解，高分子量低磺化度的木质素会抑制纤维素的酶解。提出了木质素磺酸盐可以与纤维素酶形成复合物来稳定纤维素酶，并通过改变纤维素的酶解条件得到了验证(cellulose,2014.21:1351-1359.)。

wang等发现纤维素酶与磺化木质素结合后，纤维素酶与木质纤维素底物中的木质素之间的静电排斥作用增加了，纤维素酶在木质素上的无效吸附减小了，更多的纤维素酶可以参与到纤维素的水解中，实验观察到添加磺化木质素可使预处理后的白杨树和美国黑松的葡萄糖产率分别提高了25.9％和31.8％(biotechnologyforbiofuels,2013.6:1-10.)。

lin等将一种由酶解木质素和聚乙二醇通过环氧氯丙烷交联合成的水溶性的木质素聚氧乙烯醚(ehl-peg)用于促进玉米秸秆的酶解糖化。在ehl-peg作用下，玉米秸秆的72h酶解效率从16.7％提高到70.1％，而peg4600为52.3％。当木质纤维素中木质素含量越高，ehl-peg强化酶解的效果比peg4600越显著(bioresourcetechnology,2015,185:165-170.)。

但是这些研究只是将木质素改性后应用于促进木质纤维素的酶解，并没有在酶解结束后将仍然具有活性的纤维素酶加以回收利用。

技术实现要素：

为了克服木质纤维素酶解工艺现有技术所存在的酶解效率低和纤维素酶用量大等缺点和不足，本发明的目的在于提供一种不仅可以有效地提高木质纤维素的酶解效率，回收纤维素酶，而且扩大了工业木质素的应用，不需要额外的设备，操作简单，绿色环保的利用ph响应型木质素两性表面活性剂促进木质纤维素酶解并回收纤维素酶的方法。

本发明方法首次提出了利用ph响应型木质素两性表面活性剂促进木质纤维素的酶解并通过简单的调节ph回收纤维素酶的方法。本发明以制浆造纸副产物木质素或酶解木质素为原料，经过化学反应改性成ph响应型木质素两性表面活性剂，将其用于强化木质纤维素的酶解和纤维素酶的回收。本发明木质素两性表面活性剂不仅能回收纤维素酶，而且其自身也可以回收后循环利用。

本发明的目的通过下述方案实现：

利用ph响应型木质素两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和回收纤维素酶的方法，包括以下步骤：将木质纤维素加入缓冲溶液中，再加入ph响应型木质素两性表面活性剂和纤维素酶，控制混合溶液的ph为4.0～6.2，加热至40～60℃温度下反应24～96h，得到木质纤维素的糖化水解液，通过固液分离后得到酶解液体，再调节酶解液体ph使ph响应型木质素两性表面活性剂和纤维素酶沉淀出来，循环利用。

为进一步实现本发明目的，优选地，所述ph响应型木质素两性表面活性剂为工业木质素或木质素的衍生物为原料经过化学反应引入阳离子基团和/或阴离子基团得到的具有ph响应的木质素两性表面活性剂，其中阴离子基团为羧基、磺酸基或磷酸基；所述阳离子基团为季铵基或胺基。

优选地，所述工业木质素为碱木质素、有机溶剂木质素或生物质炼制木质素，木质素的衍生物为木质素磺酸盐、木质素羧酸盐、木质素磷酸盐、木质素季铵盐或木质素胺盐。

优选地，所述ph响应型木质素两性表面活性剂为磺化季铵化木质素、磺化胺化木质素、硫酸化季铵化木质素、硫酸化胺化木质素、磷酸化季铵化木质素、磷酸化胺化木质素、羧化季铵化木质素或羧化胺化木质素。

优选地，所述ph响应型木质素两性表面活性剂中阴离子或阳离子基团的含量均大于0.3mmol/g木质素。ph响应型木质素两性表面活性剂中不同阴阳离子基团的含量为0.3～3mmol/g木质素可保证木质素两性表面活性剂ph响应的灵敏性。

优选地，所述再调节酶解液体ph使ph响应型木质素两性表面活性剂和纤维素酶沉淀出来的ph值取值为2.5-10.0。

优选地，酶解结束后通过固液分离得到酶解液体的方法为自然沉降法、倾析法、过滤法、其特征在于，所述离心法或这些方法的联合使用。

优选地，所述木质纤维素为松木、桉木、杨木、水曲柳、沙棘、伯树、杉木、桦木、玉米芯、玉米秸秆、麦秆、甘蔗渣、稻草、稻壳、食用菌基质和花生壳中的至少一种。

优选地，所述缓冲液的量为木质纤维素质量的5～50倍，ph响应型两性表面活性剂与木质纤维素的质量比为2～40：100。本发明缓冲溶液为常规纤维素酶适用缓冲溶液系统即可，如ph＝4.5～6.2，离子强度为5～200mmol/l的缓冲液。优选为醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液。

优选地，所述纤维素酶的用量以木质纤维素中的葡聚糖含量计为3～30fpu/g。

本发明ph响应型木质素两性表面活性剂在酶解的ph范围内(4.0～6.2)完全溶解在缓冲液中，酶解结束后，通过调高或调低酶解液体的ph(ph>6.2或ph<4.0)可以方便地从溶液中沉淀出来。调节酶解液体的ph值最低不超过2.5，最高不超过10.0。过高和过低的ph值都会导致纤维素酶的失活。所述的调节酶解液体中可能用到的酸为有机酸或无机酸(如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸、马来酸等)；可能用到的碱为常规的碱(如氢氧化钠，氢氧化钾，氧化钙，氢氧化钙等)。

本发明的机理为：由于ph响应型木质素两性表面活性剂的溶解度可以随ph调节，当ph在4.0～6.2时，ph响应型木质素两性表面活性剂完全溶解于缓冲液中，减少纤维素酶在木质素上的无效吸附，促进木质纤维素的酶解；当ph>6.2或ph<4.0时，ph响应型木质素两性表面活性剂析出，由于其与纤维素酶存在一定的相互作用(静电作用、疏水作用、氢键作用)，所以在ph响应型两性表面活性剂析出时会将溶液中的纤维素酶一起沉淀下来。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明以ph响应型木质素两性表面活性剂作为酶解助剂，对纯纤维素的酶解没有抑制作用，可使木质纤维素的酶解糖化得率提高16.9～78.7％。

(2)本发明中回收纤维素酶的操作简单、耗时短、不需要额外的设备，只需要简单的调节ph就可以快速地回收纤维素酶。

(3)本发明以工业木质素和木质素衍生物为原料，将其应用于强化木质纤维素酶解和纤维素酶的回收，避免了环境污染，有利于生物质资源的综合利用。

(4)本发明与目前普遍研究的将纤维素酶固定在温度响应或ph响应聚合物上来回收纤维素酶相比可以避免纤维素酶在固定反应过程中的失活。

附图说明

图1是tcsl-n28在纯水中的ph响应性情况图；

图2是ph响应型木质素两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和回收纤维素酶工艺流程图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中所用试剂均可从市场购买得到。实施例中的微晶纤维素型号为ph101(购自西格玛奥德里奇)，纤维素酶是目前被广泛使用的cellicctec2，底物包含有稀酸预处理的桉木(桉木-da)和酸性亚硫酸法处理过的松木(松木-sporl)。实施例水解液中葡萄糖浓度是通过生物传感分析仪(sba-40e，山东省生物科学研究院)测定的。

实施例涉及到三种ph响应型木质素两性表面活性剂，一种是由磺化木质素(tcsl，湖南通道神华林木有限公司生产)季铵化得到，等电点小于4.0；一种是由碱木质素(kl，湖南湘江纸业有限公司生产)季铵化得到，等电点大于7.0。一种是由木质素磺酸钠(sl，来源于杨木酸性亚硫酸钠造纸废液，由吉林石岘纸业有限责任公司生产)胺化得到，等电点小于4.0。三种ph响应型木质素两性表面活性剂的具体合成方法如下：

季铵化磺化木质素(tcsl-nx)：配制ph＝12的350gtcsl水溶液(tcsl占溶液质量分数为20％)，倒入500ml的三口烧瓶，用水浴锅将温度升到80℃后，用蠕动泵将1.0769xg质量分数为65wt％(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液往烧瓶中缓慢滴加，控制滴加速度为1ml/min，滴加5min时加入0.3721xg质量分数为20％的naoh水溶液，再继续滴加完(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液后，在80℃下反应3个小时，将得到的反应液用纯水稀释50倍后调节到ph＝3，使产品析出；x为(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵占tcsl的质量分数，x的取值范围为10～80。

季铵化碱木质素(kl-n40)：配制ph＝12的350gkl水溶液(kl占溶液质量分数为20％)，倒入500ml的三口烧瓶，用水浴锅将温度升到80℃后，用蠕动泵将43.08g质量分数为65wt％(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液往烧瓶中缓慢滴加，控制滴加速度为1ml/min，滴加5min时加入22.91g质量分数为20％的naoh水溶液，再继续滴加完(3-氯-2-羟丙基)三甲基氯化铵溶液后，在80℃下反应3个小时，将得到的反应液用纯水稀释50倍后调节到ph＝7，使产品析出。

胺化木质素磺酸钠(asl)：配制ph＝12的50gsl水溶液(sl占溶液质量分数为20％)，倒入100ml的三口烧瓶，控制搅拌速度为350rpm，设定水浴锅的温度为80℃，当温度升到50℃-55℃，加入1.5g甲醛溶液(甲醛沸点低，温度低加入)，待温度上升到80℃后，加入对应的3.657g二乙胺，在80℃下反应4h，将得到的反应液用纯水稀释50倍后调节到ph＝3，使产品析出。

实施例1

取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份ph为4.8，离子强度为50mmol/l的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入5质量份tcsl-n25，再加入10fpu/g以微晶纤维素质量计的纤维素酶，在50℃温度下反应24h，反应结束后，离心分离获得酶解液，将酶解液体的ph调至2.8，溶液出现大量沉淀后进行离心分离，再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解24h(不补充纤维素酶和木质素两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。

实施例2

取100质量份桉木-da，加入到5000质量份ph为4.8，离子强度为25mmol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，加入25质量份tcsl-n28，再加入20fpu/g以底物中葡聚糖计的纤维素酶，在50℃温度下反应48h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，将酶解液体的ph调至3.0，溶液出现大量沉淀后进行离心分离，再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解48h(不补充纤维素酶和木质素两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。

实施例3

取500质量份松木-sporl，加入到5000质量份ph为5.5，离子强度为5mmol/l的磷酸盐缓冲溶液中，加入10质量份tcsl-n30，再加入10fpu/g以底物中葡聚糖计的纤维素酶，在50℃温度下反应72h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，将酶解液体的ph调至3.0，溶液出现大量沉淀后进行离心分离,再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解72h(不补充纤维素酶和木质素两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。

实施例4

取100质量份桉木-da，加入到5000质量份ph为4.0，离子强度为5mmol/l的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入10质量份kl-n40，再加入10fpu/g以底物中葡聚糖计的纤维素酶，在50℃温度下反应48h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，将酶解液体的ph调至7.0，溶液出现大量沉淀后进行离心分离，再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解48h(不补充纤维素酶和木质素两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。

实施例5

取100质量份微晶纤维素，加入到5000质量份ph为4.8，离子强度为5mmol/l的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，加入25质量份tcsl-n28，再加入20fpu/g以微晶纤维素质量计的纤维素酶，在50℃温度下反应24h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，将酶解液体的ph调至3.0，溶液出现大量沉淀后进行离心分离,再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解48h(不补充纤维素酶和木质素两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。

实施例6

取250质量份桉木-da，加入到5000质量份ph为6.0，离子强度为5mmol/l的磷酸盐缓冲溶液中，加入15质量份asl，再加入20fpu/g以底物中葡聚糖计的纤维素酶，在50℃温度下反应48h，反应结束后，离心分离获得酶解液体，将酶解液体的ph调至3.2，溶液出现大量沉淀后进行离心分离，再将得到的固体加入到与初始酶解条件(底物和缓冲液)相同的样品中再次酶解48h(不补充纤维素酶和木质素两性表面活性剂)，通过生物传感分析仪测定两次酶解的葡萄糖含量，统计结果如表1所示。

表1木质素两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和回收纤维素酶的情况

根据表1中可以看出，木质素两性表面活性剂可以有效地促进木质纤维素的酶解，并且可以回收一定的纤维素酶，同时木质素两性表面活性剂也可以在过程中得到循环利用。

图1是tcsl-n28在纯水中的ph响应性情况图，说明了tcsl-n28具有灵敏的ph响应性，在ph>4.0时溶解，在ph<4.0时沉淀。

图2是木质素两性表面活性剂促进木质纤维素酶解和通过调节ph来回收纤维素酶的工艺流程图，过程中没有涉及到复杂的工艺，不需要额外的设备，能耗低，绿色环保。

需要说明的是，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。