一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法与流程

本发明涉及细胞库的制备方法，具体来说，涉及一种围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法。
背景技术：
：间充质干细胞（mesenchymalstemcells，mscs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，是最重要的工程种子细胞之一，可以体外大规模培养而不丧失自我更新和多向分化潜能，在药物研发、再生医学和组织工程、基因工程等领域有广阔的应用前景。2012年，osiris公司研发的用于治疗儿童急性移植物抗宿主病的prochymal在加拿大、新西兰获得上市批准，成为干细胞再生医学发展史上的标志性事件。随后，hearticellgram-ami、cupistem、cartistem、osteocel、trinity、liquidgen等mscs产品或组织工程产品获批，细胞治疗的临床应用已经进入成熟期。近些年来发现，围产期新生儿附属物，包括胎盘、羊膜、脐带中含有丰富的mscs，是最适于建立mscs生物样本库的样本资源。虽然msc的分离、培养方法不断改进，但满足细胞库存储的细胞得率仍旧不高。我们的调查发现，个体脐带mscs存储的合同约定存储量为p2代mscs1x108。按照静脉输入p3代细胞剂量1x108/疗程，大约够10个疗程，无法满足“干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)”的内部质控和质量复核的细胞量要求，因此目前的mscs库依旧是个体化治疗库，无法满足配型库制备主细胞库、工作细胞库的细胞量需求，究其原因主要是原代培养工艺落后导致原代细胞得率低造成的。针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。技术实现要素：针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种围产期脐带源mscs主细胞库的制备方法，能够提高p0代mscs得率，满足配型库的质控细胞量和移植细胞量要求。为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种围产期脐带源间mscs主细胞库的制备方法，包括如下步骤：s1.将足月剖腹产健康新生儿脐带进行无菌采集；s2.对产妇进行病原微生物筛查，对脐带样本进行无菌检测；s3.将脐带样本在生理盐水中洗净残血，用消毒酒精浸泡，再经生理盐水漂洗两次；s4.用生理盐水灌注血管，挤出残血，将脐带样本剪碎成组织块，用生理盐水漂洗3次；s5.将明胶用去离子水溶解，湿热灭菌,冷却，缓慢加入2xdmem（l），水浴摇床混匀；s6.取组织块，加入明胶溶液，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，向培养瓶中加入完全培养基，置于37℃，5%co2培养箱内培养，至细胞长满凝胶层时收获；s7.收获时以胰蛋白酶消化法收获细胞，经细胞筛过滤、离心获得p0代mscs，p0代mscs冻存，记为脐带源mscs主细胞库。进一步地，所述步骤s1中新生儿脐带进行无菌采集长度为15-20cm，两端结扎，所述步骤s3中经生理盐水漂洗两次后，需要在结扎处剪断，弃去两端。进一步地，所述步骤s3中使用75%的消毒酒精浸泡30秒。进一步地，所述步骤s2中产妇经病原微生物筛查，应无hiv、hbv、hcv、htlv、ebv、cmv、tp感染，脐带样本浸泡在生理盐水中，采集残血血样进行无菌检测，结果应为阴性，进行支原体检测，结果应为阴性。进一步地，所述步骤s5中，所用明胶为24g，以55℃100ml去离子水溶解，116℃条件下湿热灭菌15分钟,冷却至40℃，缓慢加入预温至40℃的100ml2xdmem（l）中，水浴摇床混匀。进一步地，所述dmem（l）含有4%的ultrosergserumsubstitute，所述dmem（l）中rhb-fgf的浓度为50ng/ml。进一步地，所述步骤s6中，取2cm脐带样品的组织块，加入15ml明胶溶液，搅拌混匀，转移至组织培养瓶中平铺，置于4℃冰箱中过夜后，每个培养瓶中缓慢加入15ml完全培养基，置于37℃，5%co2培养箱内培养，每3天观察，每7天换液，至细胞长满凝胶层时收获。进一步地，步骤s6中所述的完全培养基为dmem（l），所述完全培养基含有40%的mcdb201、1%的its、2%的fbs，所述完全培养基中地塞米松浓度为50nmol/l，抗坏血酸浓度为0.1mmol/l，rhlif浓度为103u/ml，rhpdgf-b浓度为10ng/ml，rhegf浓度为10ng/ml。进一步地，所述步骤s7中，收获细胞时，小心吸弃培养上清，加入5ml含0.08%edta的0.25%胰蛋白酶消化液，震荡混匀，室温消化10min；加入1ml抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；记为p0代；p0代细胞冻存，即为脐带源mscs主细胞库。本发明的有益效果：使用本发明所述的围产期脐带源间充质干细胞主细胞库的制备方法，mscs主细胞库（p0代）得率高达5x107，mscs工作细胞库（p3代）得率不少于6.5x109，除去1.5x109内部质量控制和质量复核的细胞量，至少够50个疗程的细胞输入治疗剂量，完全满足配型库的质控细胞量和移植细胞量要求。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。图1是根据本发明实施例所述的10cm脐带采用不同培养方法的mscs收率；图2是根据本发明实施例所述的对照组和半固体培养组之间的p3代生长曲线。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的器材和试剂均为本领域常用试剂，可从商业途径获得。首先，对本申请中出现的英文名称及实施例中所具体使用的各种产品的生产厂家、货号进行简要说明。mscs：mesenchymalstemcells，间充质干细胞。hiv：艾滋病毒。hbv：乙型肝炎病毒。hcv：丙型肝炎病毒。htlv：人类嗜t细胞病毒。ebv：人类疱疹病毒。cmv：巨细胞病毒。tp：梅毒螺旋体。wharton’s胶：是一根条索样的带状物，表面为羊膜所覆盖，呈白色，表面光滑、湿润，直径约1-2.5cm，脐带内有两条动脉和一条静脉，wharton’s胶即血管周围半透明的基质。dmem(l)：即lowdulbecco'smodifiedeaglemedium，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。本实施例中所使用的dmem(l)品牌为invitrogen，货号为12800017。ultrosergserumsubstitute：是一种血清替代物。本实施例中所使用的ultrosergserumsubstitute品牌为pall，货号为15950-017。rhb-fgf：重组人碱性成纤维细胞生长因子。本实施例中所使用的rhb-fgf品牌为peprotech，货号为gmp100-18b。mcdb201：一种用于成纤维样细胞的低血清或无血清培养基。本实施例中所使用的mcdb201品牌为sigma，货号为m6770。its:是一种细胞培养添加物，成分包括了三种最常用的添加物，胰岛素(iusulin)、人转铁蛋白(humantransferrin)、亚硒酸(selenousacid)。本实施例中所使用的its品牌为sigma，货号为13146。fbs：fetalcalfserum,胎牛血清。本实施例中所使用的fbs品牌为biologicalindustries，货号为04-400-1a。rhlif：重组人白细胞抑制因子。本实施例中所使用的rhlif品牌为peprotech，货号为300-05。rhpdgf-b：重组人血小板衍生因子-b。本实施例中所使用的rhpdgf-b品牌为peprotech，货号为100-14b。rhegf：重组人表皮生长因子。本实施例中所使用的rhegf品牌为peprotech，货号为gmp100-15。tgf-β3：转化生长因子-β3。本实施例中所使用的tgf-β3品牌为peprotech，货号为100-36e。明胶：本实施例中所使用的明胶品牌为prospec，货号为pro-481。地塞米松：本实施例中所使用的地塞米松品牌为sigma，货号为d1756。抗坏血酸：本实施例中所使用的抗坏血酸品牌为sigma，货号为a1300000。edta：本实施例中所使用的edta品牌为sigma，货号为60-00-4。胰蛋白酶：本实施例中所使用的胰蛋白酶品牌为biologicalindustries，货号为t6424-1vl。抑肽酶溶液：本实施例中所使用的抑肽酶溶液品牌为sigma，货号为a1250000。下面将通过具体的实施例对本发明的技术方案及所达到的技术效果进行说明。实施例一：mscs分离培养s1.将足月剖腹产健康新生儿脐带进行无菌采集,采集长度为20cm，两端结扎，产妇签署知情同意书。s2.产妇经病原微生物筛查，无hiv、hbv、hcv、htlv、ebv、cmv、tp感染感染。脐带样本浸泡在生理盐水中，采集残血血样进行无菌检测，结果为阴性，进行支原体检测，结果为阴性。s3.将脐带在生理盐水中洗净残血，在75%消毒酒精浸泡30秒左右，立即取出，生理盐水漂洗两次，在结扎处剪断，弃去两端。s4.用生理盐水灌注血管，挤出残血，将脐带样本剪碎成组织块，无需剔除血管，无需剥离wharton’s胶，用生理盐水漂洗组织块3次。s5.将24g明胶以100ml55℃去离子水溶解，116℃条件下蒸汽灭菌15分钟,冷却至40℃，缓慢加入预温至40℃的100ml2xdmem（l）（该dmem（l）含有4%的ultrosergserumsubstitute，dmem（l）中rhb-fgf的浓度为50ng/ml），40℃水浴摇床混匀。s6.取40块组织块（约2cm脐带），加入15ml明胶溶液，稍搅拌混匀，转移至组织培养瓶（培养瓶规格型号为easyflask，175cm2，nunc）中平铺；置于4℃冰箱中过夜后，每个培养瓶中缓慢加入15ml完全培养基（完全培养基为dmem（l），所述完全培养基含有40%的mcdb201、1%的its、2%的fbs，所述完全培养基中地塞米松浓度为50nmol/l，抗坏血酸浓度为0.1mmol/l，rhlif浓度为103u/ml，rhpdgf-b浓度为10ng/ml，rhegf浓度为10ng/ml），注意加入过程不要破坏明胶半固体层，置于37℃，5%co2培养箱内培养，每三天观察，第7天换液，至细胞长满凝胶层时收获，记为半固体培养组。s7.取40块组织块（约2cm脐带），以5ml无血清培养基（ultraculture，型号12-725f，品牌lonza，该培养基含有2%的ultrosergserumsubstitute）悬浮，转移至25cm2组织培养瓶（easyflask，nunc）中，置于37℃，5%co2培养箱内培养，第14天收获，记为对照组。s8.半固体组小心吸弃培养上清，加入5ml0.25%胰蛋白酶消化液，震荡混匀，室温消化10min；加入1ml抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心5min，弃上清，收获沉淀物，记为半固体组p0代；计数。对照组于第14天收获，吸弃培养上清，以生理盐水洗涤表面2次，加入5ml胰蛋白酶消化液，室温消化5分钟，以1ml抑肽酶溶液终止消化；400g离心5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；记为对照组p0代；计数。p0代mscs冻存，即为脐带源mscs主细胞库。s9.传代培养，mscs按6000个/cm2接种至新的25cm2组织培养瓶，以5ml无血清培养基（ultraculture，型号12-725f，品牌lonza，含2%的ultrosergserumsubstitute）培养至90%汇合，收获细胞，计数；连续传代至p3代。实施例二：p3代mscs生物学特征分析2.1生长曲线和群体倍增时间检测取p2代细胞，按1000/ml接种至24孔板中，每24小时以细胞成像系统（cytellcellimagingsystem，gehealthcare公司生产）计数5孔，连续6天，以细胞量为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制生长曲线；以公式td=t×lg2/lg(nt/n0)(nt为t时间的细胞数，n0为初种细胞数)计算群体倍增时间。2.2克隆率检测取p2代细胞，按100/ml接种至24孔板，隔天半量换液，培养至第12天，吸弃培养上清，进行he染色，计数cfu-f数量。2.3体外分化潜能检测2.3.1成骨分化功能取p2代细胞，按100/ml接种至24孔板，第12天时，换成骨诱导培养基（该培养基为基础培养基，含10%fbs，地塞米松浓度10-7mol/l、抗坏血酸浓度50μg/ml、β-甘油磷酸钠浓度10mmol/l），隔天换液，第28天时进行茜素红染色。2.3.2成脂肪分化功能取p2代细胞，按100/ml接种至24孔板，第12天时，换成脂诱导培养基（该培养基为基础培养基，含10%fbs，地塞米松浓度10-6mmol/l、异丁基甲基黄嘌呤浓度0.5mmol/l、吲哚美辛浓度60μmol/l、胰岛素浓度10μg/ml），隔天换液，培养至第24天时行油红o染色。2.3.3成软骨分化功能取p2代细胞，按100/ml接种至24孔板，第12天时，换成软骨诱导培养基，该培养基为基础培养基，地塞米松浓度为10-6mmol/l、抗坏血酸浓度为50μg/ml、丙酮酸钠浓度为100μg/ml、脯氨酸浓度为40μg/ml、预混的its＋浓度为50mg/ml，tgf-β3浓度为10ng/ml，隔天换液，培养至第28天时，行alcianblue染色。2.4表型检测取p3代细胞，流式细胞术检测cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr、cd73、cd90、cd105表明抗原表达。实施例三：检测结果3.1脐带源mscs得率结果10cm脐带半固体培养组培养第3天，镜下观察可以看到少量细胞爬出，培养第7天时大量细胞爬出，培养第12天时接近90%汇合，收获后细胞得率（x105）为：271.91±53.62；10cm脐带对照组培养第12天时平均24.2个组织块贴壁，周围有细胞爬出，第14天收获时，约占培养面积的60%，收获后细胞得率（x105）为：28.91±4.81，明显少于半固体培养组。取7.5x105p0代细胞以6000细胞/cm2接种至25cm2培养瓶培养至第4天收获，记为p1代细胞；取7.5x105p1代细胞以6000细胞/cm2接种至25cm2培养瓶培养至第4天收获，记为p2代细胞；取7.5x105p2代细胞以6000细胞/cm2接种至25cm2培养瓶培养至第4天收获，记为p3代细胞；计数p1、p2、p3代细胞数，核算mscs收率。如图1所示，对照组p1代收率（x105）核算为205.18±20.35，是p0代的7.01倍；p2代收率（x105）核算为1428.63±200.86，是p1代的6.96倍；p3代收率（x105）核算为9849.91±935.71，是p2代的6.89倍。半固体培养组p1代收率（x105）核算为1985.67±313.77，是p0代的7.30倍；p2代收率（x105）核算为13409.88±1102.99，是p2代的6.75倍；p3代收率（x105）核算为88684.00±10358.89，是p2代的6.61倍。对照组和半固体培养组扩增倍数相比没有显著性差异。3.2生长曲线与群体倍增时间生长曲线制备按p2代1000细胞/ml接种至24孔板，每孔1ml。每24小时计数细胞量，制作生长曲线（结果如图2所示）。对照组和半固体培养组之间几乎没有差别。按照公式td=t×lg2/lg(nt/n0)(nt为t时间的细胞数，n0为初种细胞数)计算群体倍增时间。从生长曲线可以发现，培养96小时后进入平顶期，因此计算0~96小时平均群体倍增时间。对照组为33.56小时，半固体培养组为33.89小时，二者相比没有统计学差异（p＞0.05）。3.3p3代mscscfu-f克隆率取p2代细胞，按100/ml接种至24孔板，隔天半量换液，培养至第12天，吸弃培养上清，行he染色，计数cfu-f（成纤维细胞克隆形成单位）数量，计算克隆率。对照组每100个p3代mscs平均cfu-f为32.33±9.06，半固体培养组为31.17±13.88，二者相比没有统计学差异（p＞0.05）。3.4体外分化潜能mscs体外培养过程中，部分细胞会丧失分化潜能，我们检测对照组和半固体培养组p3代细胞亚克隆的成骨、成脂肪、成软骨分化潜能，发现亚克隆的成脂肪分化潜能保留基本完整，但成骨分化潜能对照组保留76.81%、半固体培养组保留75.66%，成软骨分化潜能对照组保留50.78%、半固体培养组保留55.07%。二者相比没有显著性差异，如表1所示。表1.p3代mscs亚克隆分化潜能对照组(%)半固体培养组(%)成骨分化76.810075.6600成脂肪分化99.750099.9900成软骨分化50.780055.07003.5表型mscs的表型一定程度上代表mscs的均一性，我们检测了p3代mscs表面分子cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr、cd73、cd90、cd105的表达水平，对照组和半固体培养组均符合isct关于mscs基本要求。其中对照组cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr的表达水平高于半固体培养组（p＜0.05），说明半固体培养组p3代mscs均一性高于对照组，如表2所示。表2.p3代mscs表明抗原表达表面分子对照组半固体培养组cd11b1.04±0.160.39±0.11cd191.07±0.100.31±0.08cd340.36±0.200.17±0.05cd451.41±0.320.53±0.06hla-dr0.33±0.140.91±0.20cd7395.58±2.5998.03±0.60cd9096.91±1.7397.45±1.75cd10596.57±1.0497.36±1.13实施例四：结果分析对于干细胞研究的细胞库建设，“干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)”规范中指出：为尽量减少不同批次细胞在研究过程中的变异性，研究者在干细胞制剂的制备阶段应对来源丰富的同一批特定代次的细胞建立多级的细胞库，如主细胞库（mastercellbank)和工作细胞库（workingcellbank）。一般主细胞库存储p0代细胞，而工作细胞库根据mscs制剂的制备方法不同，存储不同代次的细胞，如果冻存mscs复苏后扩增培养后制备mscs制剂，则存储p2代细胞，如果冻存mscs复苏后直接制备mscs制剂则存储p3代细胞。满足至少50个疗程的mscs输入治疗剂量的单个脐带样本来源的mscs库才适合于配型库的要求。因此p3代mscs工作细胞库应不少于5x109。对于mscs制剂的质量控制，“干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)”规范：为确保干细胞治疗的安全性和有效性，每批干细胞制剂均须符合现有干细胞知识和技术条件下全面的质量要求。每个mscs配型库的干细胞制剂需做细胞检验和质量复核。细胞检验至少包括28项有关mscs一般生物学特征、生物学功能、危险因素、免疫学特征、致瘤性、残留物等的检测，质量复核由中国食品药品检定研究院对mscs制剂行细胞检验和质量标准复核。我们核算mscs制剂质量控制所需细胞量，p0代mscs主细胞库应不少于5x106，p3代mscs工作细胞库应不少于1.5x109。申请人发现，采用无血清培养基（ultraculture，2%ultrosergserumsubstitute）体外培养，p0代-p1代-p2代-p3代的扩增倍数平均为6.92±0.22，从p0代扩增至p3代，扩增了331.31倍。因此，核算mscs配型库工艺达标水平，p3代mscs应不少于6.5x109，p0代mscs应不少于2.5x107。现行脐带源mscs分离培养技术一般采用组织块培养法或胶原酶消化法，一根20cm脐带原代培养mscs得率大约5x106-1x107，因此p3代mscs得率大约1.66x109~3.31x109，细胞得率不足，主要原因在于原代培养细胞得率低。本研究对照组原代培养，至12天时60.50%组织块贴壁，细胞爬出后迁移性不足，密集在组织块周围，14天时每个培养40个组织块和细胞大约占15.00cm2的培养面积。半固体培养组采用白明胶固定组织块，12天时每个培养40个组织块和细胞大约占157.50cm2的培养面积，是对照组的10.5倍。因此，半固体培养组原代培养单位脐带的得率更高。mscs随着增殖倍数的增加，会逐渐损失增殖潜能和分化潜能。本研究发现，同样的扩增培养条件下，对照组和半固体培养组直至p3代的扩增倍数基本接近，没有显著性差异，而半固体培养组p3代mscs得率是对照组的9倍，世代数也应该高于对照组，但两组cfu-f克隆率、群体倍增时间没有差异，说明尽管半固体培养组mscs时代数高，仍旧没有丧失增殖潜能。同样，对照组和半固体培养组p3代亚克隆的成骨、成脂肪、成软骨分化潜能是有差别的，其中成脂肪分化潜能保留完整，而成骨和成软骨分化能力均有不同程度的丧失，但两组分化潜能相比没有显著性差异，说明半固体培养脐带mscs与现行培养方法相比，没有丧失更多的分化潜能。一般，随着扩增代数的增加，表达cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr等表面分子的非mscs细胞比例急剧下降，而mscs细胞表面分子cd73、cd90、cd105的表达水平逐渐提高。isct规定，均一性较好的mscs，其表面分子cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr的表达均应低于2%，而cd73、cd90、cd105的表达水平均应高于95%，这个表型指标限制了非mscs类的杂细胞和分化细胞。本研究对照组和半固体培养组培养至p3代，表面分子表达水平均符合isct的规定，而且后者的cd11b、cd19、cd34、cd45、hla-dr的表达水平更低，说明半固体培养组p3代mscs的均一性更好，而且分化的更少。综上所述，本发明通过半固体法培养脐带组织块，有效提高了原代培养mscs得率，而没有丧失增殖潜能和分化潜能，并且均一性更高，是一种能够满足脐带源mscs配型库主细胞库要求的原代制备技术。当前第1页12