经干扰序列修饰的TGF‑β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种经干扰序列修饰的tgf-β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用。

背景技术：

白血病患者治疗后复发是影响患者长期生存的主要因素，其根本原因是治疗后体内残留的白血病细胞所致。而传统手段则主要依靠大剂量巩固化疗和异基因造血干细胞移植来清除缓解期患者体内残留的白血病细胞，其中移植物中异基因淋巴细胞的抗白血病作用至关重要，但是这种非特异性的免疫效应常常伴有严重移植物抗宿主病，是目前造血干细胞移植的主要死亡原因。免疫治疗可特异性清除白血病患者治疗后体内残留白血病细胞，减少和预防白血病复发，延长患者的生存期，改善白血病的预后。数个临床研究表明抗肿瘤疫苗对白血病有一定的疗效，是白血病治疗的一个很有希望的发展方向。探寻更有针对性，操作简便，适合临床应用的白血病细胞特异性免疫治疗一直是白血病等恶性血液肿瘤治疗研究的热点。

外泌体是直径为40-100nm，由真核细胞释放的，含有多种细胞膜分子以及相关蛋白的小囊泡。多种类型细胞尤其是造血系统来源的细胞均能释放exo。其中包括抗原提呈细胞如树突状细胞(dendriticcells,dcs)、淋巴细胞、肥大细胞、肠上皮细胞以及多种肿瘤细胞等。近年来有研究证实肿瘤细胞来源的exo(tumorcell-derivedexosomes,tex)负载有肿瘤细胞相关抗原，可被树突状细胞吞噬，并能诱导肿瘤特异性的ctl反应，因为有望成为理想的抗肿瘤疫苗来源。alter等报道浆细胞瘤源性的外泌体疫苗可保护80％小鼠免受肿瘤攻击，并可有效抑制肿瘤生长。yao等报道白血病细胞同样可以释放外泌体(leukemiacell-derivedexosome,lex)，且可被dc摄取.lex靶向结合的dc细胞可显著提高荷瘤小鼠的生存率，并减缓肿瘤生长。因此以白血病源性外泌体为基础的抗白血病疫苗可有望安全有效地清除白血病缓解期患者体内残余的微小残留病灶。

在一项i期临床试验中，dai等分离患者恶性腹水的外泌体作为特异性抗肿瘤疫苗来源，单独应用外泌体疫苗或联合免疫佐剂gm-csf治疗iii/iv期肠癌患者。结果显示，未经修饰的肿瘤外泌体疫苗虽表现出良好的安全性，并可在体外诱导dth反应。然而大部分患者却未从治疗中获益。未经修饰的肿瘤源性外泌体虽可诱导一定的抗原特异性免疫反应，然而其免疫原性相对较弱，临床疗效仍不乐观。更为重要的是，有研究显示，肿瘤细胞释放的外泌体(tumorcell-derivedexosomes,tex)可能对宿主免疫系统有抑制效应，甚至有促进肿瘤细胞生长的作用。

由于未经修饰的tex疫苗抗肿瘤效应有限，因此优化以tex为基础的肿瘤疫苗，提高其免疫原性从而诱导更强大的抗肿瘤特异性免疫应当是提其临床应用价值的关键。研究发现，tex中富集有诸如fas-l、tgf-β1，pd-1l等免疫抑制因子。其中tgf-β1是其中最为重要的免疫抑制因子，其可通过阻碍dc细胞成熟，抑制t细胞增殖、促进cd8⁺t细胞凋亡，诱导调节性t细胞增殖、下调t细胞和nk细胞的nkg2d受体等方式显著削弱tex疫苗的抗肿瘤效应。因此，为了提高外泌体疫苗的免疫效力，本发明通过在白血病细胞中采用基因修饰手段缄默其tgf-β1的表达水平，从而下调白血病细胞来源的外泌体(lex)负载的tgf-β1含量。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种经干扰序列修饰的tgf-β1缄默的白血病细胞外泌体及其制备方法和应用，由该白血病源性外泌体(lextgf-β1si)致敏的dc疫苗(dclex-tgf-β1si)，其免疫原性较未经改造的lex所致敏的dc疫苗(dclex)与lexgfp致敏的dc(dclex-gfp)疫苗明显增强。

本发明采用如下技术方案：

经干扰序列修饰的tgf-β1缄默的白血病细胞外泌体，所述外泌体是由经干扰序列修饰的tgf-β1缄默的白血病细胞分泌的，所述干扰序列为shrna1、shrna2或shrna3。

更进一步地，所述shrna1的序列如seqidno:1、seqidno:2所示，所述shrna2的序列如seqidno:3、seqidno:4所示，所述shrna3的序列如seqidno:5、seqidno:6所示。

本发明还提供所述的经干扰序列修饰的tgf-β1缄默的白血病细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：

步骤一，白血病细胞的培养；

步骤二，制备干扰序列修饰的白血病细胞；

步骤三，外泌体的抽提与纯化。

步骤四，经修饰后的白血病细胞外泌体靶向致敏的树突状细胞疫苗作为保护性肿瘤疫苗的抗白血病效应检测；

步骤五，经修饰后的白血病细胞外泌体靶向致敏的树突状细胞疫苗在荷瘤小鼠中的效应检测。

更进一步地，步骤一具体为：

a)配置好含有10％胎牛血清的1640完全培养基，所述培养基内含100u/ml青霉素钠和100ug/ml硫酸链霉素，将冻有l1210细胞的冻存管从液氮罐中取出后直接投入37℃温水中，并轻轻摇动使其尽快融化，取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，转移到15ml尖底离心管，并滴加10倍以上的培养液，离心1200rpm×10min，弃上清，新鲜的完全培养液重悬后接种至培养瓶；

b)培养瓶置于37℃、5％co2培养箱内孵育，细胞呈悬浮生长，每1－2d换液或传代。

更进一步地，步骤二为：构建含有干扰序列基因的tgf-β1rna干扰慢病毒，用得到的慢病毒转染白血病细胞，得到经干扰序列修饰的白血病细胞。

更进一步地，步骤二具体步骤为：

a)根据genebank中tgf-β1核苷酸序列及sirna设计shrna1、shrna2及shrna3靶点序列，同时合成与tgf-β1基因序列无关的sirna作为阴性对照，序列经同源分析后，合成含有干扰序列的双链dnaoligo，其两端含有酶切位点粘段，连入酶切后的phblv-u6-scramble-zsgreen表达载体上，将连接好的质粒转入大肠杆菌dh5a，挑选阳性重组菌落进行pcr鉴定及测序比对后，鉴定为阳性克隆，即构建成功tgf-β1rna干扰慢病毒载体；

b)构建好的慢病毒穿梭质粒与其慢病毒包装载体质粒(pspax2，pmd2g)分别进行高纯度无内毒素抽提，然后共转染293t细胞，转染6小时后，更换为完全培养基，培养48小时及72小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞培养上清，对其浓缩后获得高滴度的慢病毒浓缩液；

c)取对数期白血病细胞，接种于24孔板中，每孔细胞数10⁵个，每组设3复孔，每组以感染复数(moi)值100分别加入携带有shrna1、shrna2、shrna3和作为阴性对照的shrna(shrnanc)的慢病毒，每孔感染复数(moi)值均为100，加入polybrane8ug/ml充分混匀后，室温下，2000g离心90分钟，离心后置于5％co2，37℃细胞培养箱中，24小时后，更换完全培养基，转染72小时后，分选出各组中gfp阳性细胞，得到经干扰序列修饰的白血病细胞。通过pcr技术对经干扰序列修饰的白血病细胞的tgf-β1水平进行检测，选择tgf-β1缄默最显著的细胞作为提取外泌体的来源，并将该细胞命名为l1210tgf-β1，将感染了shrnanc慢病毒的白血病细胞命名为l1210gfp。

更进一步地，步骤三具体步骤为：

1)收集对数期l1210细胞，加入pbs，吹打混匀后1200rpm离心10min，弃上清；

2)调整细胞密度为5×10⁶/ml，转移至aim-v无血清培养基中，置于37℃、5％co2培养箱内孵育36h，离心收集细胞培养上清；

3)收集无血清培养的l1210细胞上清液，800g低温离心(4℃，下同)30min去除细胞取上清液；

4)10，000g低温离心1h去除细胞碎片取上清液；

5)100，000g低温超速离心1h弃上清液；

6)将沉淀溶于pbs中，再于4℃下100，000×g超速离心60min，沉淀用适量pbs重悬，获得白血病细胞来源的外泌体，收集并-80℃冻存备用。将将来源于l1210，l1210gfp,l1210tgf-β1si的外泌体分别命名为lex,lexgfp，lextgf-β1si。

更进一步地，步骤四具体步骤为：

1)分离小鼠骨髓单个核细胞，体外通过含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和白细胞介素4(il-4)诱导培养小鼠树突状细胞,每3天行半量换液，培养第六天，计数收集dc；

2)每1×10⁶个dc分别于lex(10μg),lexgfp(10μg)，lextgf-β1si(10μg)共孵育过夜，以致敏dc，将由lex,lexgfp，lextgf-β1si致敏的dc分别命名为dclex,dclex-gfp，dclex-tgf-β1si。

3)将6-8周龄dba/2雌性小鼠随机分为5组，每组10只；

4)在第0、7、14天给予dba/2小鼠在左侧大腿皮下分别预防性接种pbs(100μl)、dc(1x10⁶个/只)、dclex(1x10⁶个/只)、dclex-gfp(1x10⁶个/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶个/只)；

5)第21天取对数期生长的l1210白血病细胞，800g离心5分钟弃上清，无血清dmem培养基重悬细胞，800g离心5分钟，细胞计数，调整细胞密度至5x10⁶/ml，各组中每只小鼠右侧大腿皮下注射细胞悬液各100μl(含有5x10⁵个细胞)；

6)接种肿瘤细胞后，观察各组小鼠肿瘤生长情况并记录。

更进一步地，步骤五具体步骤为：

1)将6-8周龄dba/2雌性小鼠随机分为5组，每组10只；

2)取对数期生长的l1210白血病细胞，800g离心5分钟弃上清，无血清dmem培养基重悬细胞，800g离心5分钟，细胞计数，调整细胞密度至5x10⁶/ml，各组中每只小鼠右侧大腿皮下注射细胞悬液各100μl(含有5x10⁵个细胞)；

3)分离小鼠骨髓单个核细胞，体外通过含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和白细胞介素4(il-4)诱导培养小鼠树突状细胞(dendriticcells,dc)，每3天行半量换液，培养第六天，计数收集dc；

4)每1×10⁶个dc分别于lex(10μg)，lexgfp(10μg)，lextgf-β1si(10μg)共孵育过夜，以致敏dc；

5)肿瘤接种5天后，各组小鼠左侧大腿皮下分别接种pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶个/只)、dclex(1x10⁶个/只)、dclex-gfp(1x10⁶个/只)、dclex-tgf-β1s(1x10⁶个/只)；

6)每日观察小鼠肿瘤生长情况，用游标卡尺测量小鼠荷瘤直径，记录小鼠生存率.

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明通过携带shrna的慢病毒载体缄默外泌体来源细胞的tgf-β1表达，从而生产纯化出tgf-β1含量下调的白血病细胞源性外泌体，即lextgf-β1si。将改造后的白血病细胞源性外泌体致敏树突状细胞dc，制备成dclex-tgf-β1si疫苗。经改造优化的白血病源性外泌体(lextgf-β1si)所致敏的dclex-tgf-β1si疫苗，其免疫原性较未经改造的lex所致敏的dc疫苗(dclex)与lexgfp致敏的dc(dclex-gfp)疫苗明显增强。dclex-tgf-β1si表面共刺激分子(cd80和cd86)及mhcii类分子表达较dclex、dclex-gfp显著升高，同时dclex-tgf-β1si所分泌的细胞因子il-12p40和tnf-a较dclex、dclex-gfp也显著增加。而其tgf-β1的分泌水平则较dclex、dclex-gfp显著下降。提示lextgf-β1si所致敏的dc细胞在表型上与功能上更趋近于成熟。通过dclex-tgf-β1si疫苗效力的检测可见，dclex-tgf-β1si疫苗可较普通lex致敏的dc疫苗更有效地诱导cd4⁺t细胞增殖反应，th1细胞因子分泌效应以及特异性ctl反应。动物实验检测疫苗体内效力的结果显示dclex-tgf-β1si作为肿瘤预防疫苗，可更为有效地保护小鼠免受肿瘤进攻。而dclex-tgf-β1si作为肿瘤治疗疫苗时，其可有效抑制肿瘤生长，并延长小鼠的荷瘤生存时间。总之，经优化改造的dclex-tgf-β1si疫苗可产生较未经修饰的lex所致敏的dc疫苗更为强大的特异性抗肿瘤免疫应答，其疫苗效力较前显著提升。

附图说明

图1为经改造的lex的特征图；图1a可见电镜下观察经改造的lex，即lextgf-β1si，符合典型的外泌体形态，直径为30—100nm,形态均一,为圆形或椭圆形囊泡结构。通过对所提取的外泌体样品进行westernblot蛋白分析可见，所提取的白血病细胞外泌体样本均表达外泌体特征性蛋白cd9，cd63，hsp70(图1b)。图1c示l1210细胞经过tgf-β1shrna慢病毒修饰后，其tgf-β1表达水平显著下调。图1d示，来源于tgf-β1缄默的l1210细胞的外泌体其tgf-β1含量显著下调。

图2为改造后的lex对其锚定的dc细胞特性影响，由图可见，dclex-tgf-β1si表面的cd80，cd86和mhcii类分子较dclex与dclex-gfp明显上调(图2a)，此外细胞因子tnf-α,il-12p70的分泌水平较dclex与dclex-gfp显著升高(图2b,c)，提示lextgf-β1si锚定的dc细胞，其成熟程度及抗原递呈功能较dclex与dclex-gfp更佳。此外dclex-tgf-β1si所分泌的免疫抑制因子tgf-β1的水平较dclex与dclex-gfp显著降低(图2d)，提示dclex-tgf-β1si可能具有更强的免疫原性。imdc：未成熟树突状细胞；dclex：lex致敏的树突状细胞；dclex-gfp：lexgfp致敏的树突状细胞。dclex-tgf-β1si：lextgf-β1si致敏的树突状细胞；mdc：经lps刺激成熟的树突状细胞；

图3为改造后的lex致敏dc细胞的新型疫苗可更有效地诱导特异性cd4⁺和cd8⁺t细胞反应，由图可见，dclex-tgf-β1si可更有效地诱导抗白血病特异性cd4⁺t细胞扩增及th1细胞因子，并产生更为强大的ctl反应。(**)表示p<0.01，(*)表示p<0.05；p<0.05提示存在显著性差异。

图4为用改造后的lex致敏dc细胞的新型疫苗可有效发挥肿瘤治疗效应。由图可见，dclex-tgf-β1si疫苗用于治疗荷瘤小鼠，其可显著延长荷瘤小鼠的中位生存时间，并有效抑制肿瘤生长的影响，其效应显著优于dclex和dclex-gfp疫苗。pbs:pbs缓冲液；dc:未结合外泌体的树突状细胞；dclex：lex致敏的树突状细胞；dclex-gfp:lexgfp致敏的树突状细胞。dclex-tgf-β1si：lextgf-β1si致敏的树突状细胞。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

经干扰序列修饰的tgf-β1缄默的白血病细胞外泌体，所述外泌体是由经干扰序列修饰的tgf-β1缄默的白血病细胞分泌的，所述干扰序列为shrna1、shrna2或shrna3。

更进一步地，所述shrna1的序列如seqidno:1、seqidno:2所示，所述shrna2的序列如seqidno:3、seqidno:4所示，所述shrna3的序列如seqidno:5、seqidno:6所示。

本发明还提供所述的经干扰序列修饰的tgf-β1缄默的白血病细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：

步骤一，白血病细胞的培养；

步骤二，制备干扰序列修饰的白血病细胞；

步骤三，外泌体的抽提与纯化。

步骤四，经修饰后的白血病细胞外泌体靶向致敏的树突状细胞疫苗作为保护性肿瘤疫苗的抗白血病效应检测；

步骤五，经修饰后的白血病细胞外泌体靶向致敏的树突状细胞疫苗在荷瘤小鼠中的效应检测。

更进一步地，步骤一具体为：

a.配置好含有10％胎牛血清的1640完全培养基，所述培养基内含100u/ml青霉素钠和100ug/ml硫酸链霉素，将冻有l1210细胞的冻存管从液氮罐中取出后直接投入37℃温水中，并轻轻摇动使其尽快融化，取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，转移到15ml尖底离心管，并滴加10倍以上的培养液，离心1200rpm×10min，弃上清，新鲜的完全培养液重悬后接种至培养瓶；

b.培养瓶置于37℃、5％co2培养箱内孵育，细胞呈悬浮生长，每1－2天换液或传代。

更进一步地，步骤二为：构建含有靶向tgf-β1干扰序列基因的干扰慢病毒，用得到的慢病毒转染白血病细胞，得到经干扰序列修饰的白血病细胞。

更进一步地，步骤二具体步骤为：

a)根据genebank中tgf-β1核苷酸序列及sirna设计shrna1、shrna2及shrna3靶点序列，同时合成与tgf-β1基因序列无关的sirna作为阴性对照，序列经同源分析后，合成含有干扰序列的双链dnaoligo，其两端含有酶切位点粘段，连入酶切后的phblv-u6-scramble-zsgreen表达载体上，将连接好的质粒转入大肠杆菌dh5a，挑选阳性重组菌落进行pcr鉴定及测序比对后，鉴定为阳性克隆，即构建成功tgf-β1rna干扰慢病毒载体；

b)构建好的慢病毒穿梭质粒与其慢病毒包装载体质粒(pspax2，pmd2g)分别进行高纯度无内毒素抽提，然后共转染293t细胞，转染6小时后，更换为完全培养基，培养48小时及72小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞培养上清，对其浓缩后获得高滴度的慢病毒浓缩液；

c)取对数期白血病细胞，接种于24孔板中，每孔细胞数10⁵个，每组设3复孔，每组以感染复数(moi)值100分别加入携带有shrna1、shrna2、shrna3和作为阴性对照的shrna(shrnanc)的慢病毒，每孔感染复数(moi)值均为100，加入polybrane8ug/ml充分混匀后，室温下，2000g离心90分钟，离心后置于5％co2，37℃细胞培养箱中，24小时后，更换完全培养基，转染72小时后，分选出各组中gfp阳性细胞，得到经干扰序列修饰的白血病细胞。通过pcr技术对经干扰序列修饰的白血病细胞的tgf-β1水平进行检测，选择tgf-β1缄默最显著的细胞作为提取外泌体的来源，并将该细胞命名为l1210tgf-β1，将感染了shrnanc慢病毒的白血病细胞命名为l1210gfp。

更进一步地，步骤三具体步骤为：

1)收集对数期l1210细胞，加入pbs，吹打混匀后1200rpm离心10min，弃上清；

2)调整细胞密度为5×10⁶/ml，转移至aim-v无血清培养基中，置于37℃、5％co2培养箱内孵育36h，离心收集细胞培养上清；

3)收集无血清培养的l1210细胞上清液，800g低温离心(4℃，下同)30min去除细胞取上清液；

4)10，000g低温离心1h去除细胞碎片取上清液；

5)100，000g低温超速离心1h弃上清液；

6)将沉淀溶于pbs中，再于4℃下100，000×g超速离心60min，沉淀用适量pbs重悬，获得白血病细胞来源的外泌体，收集并-80℃冻存备用。将将来源于l1210，l1210gfp,l1210tgf-β1si的外泌体分别命名为lex,lexgfp，lextgf-β1si。

更进一步地，步骤四具体步骤为：

1)分离小鼠骨髓单个核细胞，体外通过含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和白细胞介素4(il-4)诱导培养小鼠树突状细胞(dendriticcells,dc),每3天行半量换液，培养第六天，计数收集dc；

2)每1×10⁶个dc分别于lex(10μg),lexgfp(10μg)，lextgf-β1si(10μg)共孵育过夜，以致敏dc，将由lex,lexgfp，lextgf-β1si致敏的dc分别命名为dclex,dclex-gfp，dclex-tgf-β1si。

3)将6-8周龄dba/2雌性小鼠随机分为5组，每组10只；

4)在第0、7、14天给予dba/2小鼠在左侧大腿皮下分别预防性接种pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶个/只)、dclex(1x10⁶个/只)、dclex-gfp(1x10⁶个/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶个/只)；

5)第21天取对数期生长的l1210白血病细胞，800g离心5分钟弃上清，无血清dmem培养基重悬细胞，800g离心5分钟，细胞计数，调整细胞密度至5x10⁶/ml，各组中每只小鼠右侧大腿皮下注射细胞悬液各100μl(含有5x10⁵个细胞)；

6)接种肿瘤细胞后，观察各组小鼠肿瘤生长情况并记录。

更进一步地，步骤五具体步骤为：

1)将6-8周龄dba/2雌性小鼠随机分为5组，每组10只；

2)取对数期生长的l1210白血病细胞，800g离心5分钟弃上清，无血清dmem培养基重悬细胞，800g离心5分钟，细胞计数，调整细胞密度至5x10⁶/ml，各组中每只小鼠右侧大腿皮下注射细胞悬液各100μl(含有5x10⁵个细胞)；

3)分离小鼠骨髓单个核细胞，体外通过含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和白细胞介素4(il-4)诱导培养小鼠树突状细胞(dendriticcells,dc)，每3天行半量换液，培养第六天，计数收集dc；

4)每1×10⁶个dc分别于lex(10μg)，lexgfp(10μg)，lextgf-β1si(10μg)共孵育过夜，以致敏dc；

5)肿瘤接种5天后，各组小鼠左侧大腿皮下分别接种pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶个/只)、dclex(1x10⁶个/只)、dclex-gfp(1x10⁶个/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶个/只)；

6)每日观察小鼠肿瘤生长情况(游标卡尺测量小鼠荷瘤直径)，记录小鼠生存率。

实施例1tgf-β1含量下调的l1210源性外泌体的制备

一、tgf-β1shrna慢病毒的构建

1.tgf-β1shrna慢病毒载体制备

tgf-β1干扰慢病毒载体由上海汉恒生物科技有限公司设计合成。根据genebank中tgf-β1核苷酸序列及sirna设计出3条最佳靶点序列。分别命名为shrna1,shrna2,shrna3。序列如下表。同时合成与tgf-β1基因序列无关的sirna作为阴性对照(negativecontrol)，命名为shrnanc。序列经同源分析后，由上海生工生物合成含有干扰序列的双链dnaoligo,其两端含有酶切位点粘段，连入酶切后的phblv-u6-scramble-zsgreen表达载体上。将连接好的质粒转入大肠杆菌dh5a，挑选阳性重组菌落进行pcr鉴定及测序比对后，鉴定为阳性克隆即为构建成功的tgf-β1rna干扰慢病毒载体。

2.慢病毒包装及滴度测定

构建好的慢病毒穿梭质粒与其慢病毒包装载体质粒(pspax2，pmd2g)分别进行高纯度无内毒素抽提。然后共转染293t细胞，转染6小时后，更换为完全培养基。培养48小时及72小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞培养上清，对其浓缩后获得高滴度的慢病毒浓缩液。将慢病毒颗粒分别转染293t细胞后根据倍比稀释法，检测病毒滴度，选择最佳病毒滴度进行后续试验。

小鼠tgf-β1引物(360bp)：

正义链为：5’-gcaccatccatgcaatgaac-3’；(seqidno:7)

反义链为5’-ttgcaggagcgcacaatgat-3’(seqidno:8)

小鼠β-actin引物(349bp)：

正义链为：5’-tggaatccttgtgcatccatgaaa-3’；(seqidno:9)

反义链：5’-taaaacgcagctcagtaacagtccg-3’(seqidno:10)

tgf-β1干扰序列设计如下：

sirna1序列：cgaagcggactactatgctaa(seqidno:11)

shrna1序列：

表1shrna1序列表

sirna2序列：gagcaacatgtggaactctaccaga(seqidno:12)

shrna2序列：

表2shrna2序列表

sirna3序列：cggagagccctggataccaactatt(seqidno:13)

shrna3序列：

表3shrna3序列表

二、慢病毒转染l1210细胞及干扰效率测试

取对数期l1210细胞，接种于24孔板中，每孔细胞数10⁵个，每组设3复孔。每组以感染复数(moi)值100分别加入携带有shrna1、shrna2、shrna3和shrnanc的慢病毒，每孔感染复数(moi)值均为100，加入polybrane8ug/ml充分混匀后，室温下，2000g离心90分钟。离心后置于5％co2，37℃细胞培养箱中。24小时后，更换完全培养基。转染72小时后，流式细胞仪分选出各组中gfp阳性细胞。

通过trizolrna提取试剂分别提取各组细胞中总rna，并逆转录成cdna。以各组cdna为模板，进行real-timepcr，根据相对定量法计算目的片段的扩增比例。各样本重复3次。pcr检测结果如下。其中以shrna3对l1210细胞tgf-β1基因转录的干扰效率最为显著。随后通过流式细胞仪对shrna慢病毒感染的l1210细胞及未进行基因修饰的l1210细胞进行tgf-β1蛋白检测。实验结果显示，tgf-β1-sh3所感染的l1210细胞表面tgf-β1表达水平显著低于其他两组细胞，证实通过携带有tgf-β1-sh3干扰序列的重组慢病毒可有效缄默l1210细胞tgf-β1基因及蛋白的表达水平(图1c)。将感染了tgf-β1-sh3的l1210细胞，命名为l1210tgf-β1si，并将其作为分离外泌体的来源细胞之一，

三、l1210tgf-β1si来源的外泌体分离及特征鉴定

1.外泌体提取

1)收集对数期l1210细胞，加入pbs，吹打混匀后1200rpm离心10min，弃上清。

2)调整细胞密度为5×10⁶/ml，转移至aim-v无血清培养基中，置于37℃、5％co2培养箱内孵育36h，离心收集细胞培养上清。

3)收集无血清培养的l1210细胞上清液，800g低温离心(4℃，下同)30min去除细胞取上清液。

4)10，000g低温离心1h去除细胞碎片取上清液。

5)100，000g低温超速离心1h弃上清液。

6)将沉淀溶于pbs中，再于4℃下100，000×g超速离心60min1h，沉淀用适量pbs重悬，获得白血病细胞来源的外泌体，收集并-80℃冻存备用。将来源于l1210，l1210gfp，l1210tgf-β1si的外泌体分别命名为lex,lexgfp，lextgf-β1si。

2.lex的蛋白定量测定(bca法)

1)取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mgbsa)中，充分溶解后配制成25mg/l的蛋白标准溶液，取20ul稀释至终浓度为0.5ml/ml，其余-20度长期保存。

2)根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50：1)配制适量bca工作液，充分混匀。

3)将标准品按0，1，2，3，4，8，12，16，20ul加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20ul。

4)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20ul。

5)各孔加入200ulbca工作液，37℃放置20～30分钟。

6)测定a562，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

3.外泌体特征鉴定

投射电镜观察外泌体样本形态特征：

1)用parafilm膜平整黏贴于玻璃表面

2)将50微升外泌体样本滴于膜上

3)将带有formvar支持膜的铜网覆盖在样品滴上，使其漂浮(有支持膜的那面朝下)3-10分钟，使样本吸附到支持膜上。

4)将50微升2％的磷钨酸染液滴于parafilm膜上。

5)将铜网移离样品液滴，用小片滤纸置于铜网边缘以吸去铜网上液体，再将此吸附有样品的铜网覆盖到2％的磷钨酸染液液滴上漂浮3分钟，滤纸沿铜网边缘吸干，白炽灯下干燥10分钟。

6)投射电镜(phillipcm120)下观察。

如图1a所示，电镜下观察课件lextgf-β1si为直径在40-100nm的盘状囊泡，符合典型外泌体的形态特征。

westernblot检测所分离的外泌体中hsp70，cd9，cd63表达情况：

1)将裂解液和酶抑制剂以体积比50：1混合，取适量的裂解液混合物加入到外泌体样品沉淀中。

2)冰上放置20分钟后，4℃，12000g离心20分钟。

3)收集上清，bradford法蛋白质浓度测定。

4)在冰上配制sds聚丙烯酰胺凝胶(分离胶与浓缩胶)

5)将冰上配置好的分离胶混匀后缓慢注入两玻璃板之间，异丙醇液封，室温静止30分钟至胶凝固，小心弃去异丙醇并用蒸馏水清洗，吸干残留。

6)注入sds-page浓缩胶玻，小心插入齿梳，排净气泡，室温静置直到胶完全凝固。

7)将玻璃板放进电泳槽，用1×电泳缓冲液加满电泳槽，轻轻拔出梳子，每个样品按30μg上样，空置孔加入15μl加样缓冲液。

8)接通电源，调节电压80v，电泳约40分钟后，当溴酚蓝染料从浓缩胶进入分离胶，调节电压至120v，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部停止。

9)剥胶板小心撬开玻板，将胶浸入转膜缓冲液中平衡10分钟。依据胶的大小裁剪pvdf膜，放入甲醇中浸泡10分钟后置于转膜缓冲液中平衡2-3分钟；

10)以转膜架子黑色面为底，依次放置毡垫、3层滤纸、胶、pvdf膜、3层滤纸、毡垫，驱赶干净气泡，夹紧架子，放入电转仪中；

11)加入转膜缓冲液，放入冰盒，冰浴下恒流200ma，转膜60分钟，转膜结束后取出杂交膜。

12)将完成蛋白转膜的pvdf膜置于5％tbs配置的脱脂牛奶中于室温摇床上封闭2小时。

13)根据抗体说明书，一抗稀释液均按照1:1000稀释一抗(抗hsp70，抗cd63，抗cd9)；

14)孵育过夜

15)1×tbst室温洗3次，每次10分钟；

16)按照一定比例稀释二抗(1:1000)室温孵育1小时；

17)1×tbst室温洗3次，每次10分钟；

18)配制ecl发光显色液，向膜上滴加适量进行化学发光，用bio-redchemidoc^tmxrs+化学发光成像系统检测图像；

19)定量使用imagelab软件测定灰度值。

如图1b所示：在lex,lexgfp，lextgf-β1si中均能检测出cd9，cd63与hsp70这些外泌体标志性蛋白，证实我们所获得的外泌体样本为典型白血病细胞来源的外泌体

elisa检测lex中tgf-β1含量：

1)生物素标记抗小鼠tgf-β1抗体工作液的准备：按1μl生物素标记抗人tgf-β1加抗体稀释液99μl的比例配制成工作液。

2)根据每孔需要0.1ml计算总的用量。按1μl亲和素-过氧化物酶复合物(abc)加abc稀释液99μl的比例配制工作液。轻轻混匀。

3)将10,000pg/ml，5000pg/ml，2500pg/ml，1250pg/ml，625pg/ml，312pg/ml，156pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。

4)酶标板加上盖，37℃反应90分钟。

5)反应后吸去酶标板内的液体。将准备好的生物素抗小鼠tgf-β1抗体工作液按每孔0.1ml依次加入，tmb空白显色孔除外。37℃反应60分钟

6)用0.01mtbs或0.01mpbs洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。

7)将准备好的abc工作液按每孔0.1ml依次加入，tmb空白显色孔除外。

37℃反应30分钟。

8)0.01mtbs或0.01mpbs洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。

9)按每孔90μl依次加入已在37℃平衡30分钟的tmb显色液，37℃避光反应5-20分钟。

10)按每孔0.1ml依次加入tmb终止液。

11)用酶标仪在450nm测定od值。从而得出待测样品的最终浓度。

elisa检测结果显示，来源于tgf-β1缄默的l1210细胞的外泌体，其每100μg中tgf-β1蛋白的含量仅为5.8±0.7pg/10μg，显著低于未经修饰及转入对照慢病毒的l1210细胞16.9±2.1pg/10μg，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例2tgf-β1含量下调的l1210源性外泌体靶向致敏的树突状细胞疫苗(dclex-tgf-β1si)

诱导生成树突状细胞(dendriticcells,dcs)

小鼠骨髓dc的分离和培养：

1)取三只6～8周小鼠，处死，75％酒精浸泡1分钟。

2)剪开小鼠背部皮肤，将皮肤拉至膝关节以下，剪断膝关节和髂关节处，放入pbs中。

3)准备2个10cm培养皿，将组织置入培养皿中，修剪组织，以方便暴露骨端。

4)将处理后的组织放入另一10cm培养皿，加入1640培养基。

5)准备10ml针筒，注满1640培养基剪开股骨两端，用1ml针筒冲洗骨髓腔，可见长条骨髓或者红色液体流出。

6)收集冲洗液入50ml离心管，冲洗培养皿，离心，4度、1200rpm，5min

7)弃上清，加入3ml红细胞裂解液，裂解4分钟，加入pbs或1640培养液终止。4度、1200rpm离心5min。

8)弃上清，加入1640洗涤一次，离心，4度、1200rpm，10min，弃上清。

9)配制10％fbs培养液50ml，加入1支gm-csf(20ng/l)，1支il-4(20ng/l)。取18ml重悬细胞。接种于6孔板中，每孔3ml，5％co2培养箱中培养。

10)培养液变黄，换液：将6孔板稍倾斜，每孔去除2ml液体，加入完全培养液(每孔2ml)，补足细胞因子。

11)培养第六天，轻轻并计数收集dc

12)第6天轻轻吹打收集dc，计数，每1×10⁶个dc分别于10ug的白血病源性外泌体共孵育过夜。

13)收集致敏的dc细胞，备用。

dclex-tgf-β1si免疫小鼠对肿瘤的预防作用：

1)将6-8周龄dba/2雌性小鼠随机分为5组，每组10只；

2)在第0、7、14天给予dba/2小鼠在左侧大腿皮下分别预防性接种pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶个/只)、dclex(1x10⁶个/只)、dclex-gfp(1x10⁶个/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶个/只)；

3)第21天取对数期生长的l1210白血病细胞，800g离心5分钟弃上清，无血清dmem培养基重悬细胞，800g离心5分钟，细胞计数，调整细胞密度至5x10⁶/ml。各组中每只小鼠右侧大腿皮下注射细胞悬液各100μl(含有5x10⁵个细胞)。

4)接种肿瘤细胞后，观察各组小鼠肿瘤生长情况并记录。

6.dclex-tgf-β1si疫苗小鼠对肿瘤的治疗作用

1)将6-8周龄dba/2雌性小鼠随机分为5组，每组10只。

2)取对数期生长的l1210白血病细胞，800g离心5分钟弃上清，无血清dmem培养基重悬细胞，800g离心5分钟，细胞计数，调整细胞密度至5x10⁶/ml。各组中每只小鼠右侧大腿皮下注射细胞悬液各100μl(含有5x10⁵个细胞)。

3)5天后，各组小鼠左侧大腿皮下分别接种pbs(100μl/只)、dc(1x10⁶个/只)、dclex(1x10⁶个/只)、dclex-gfp(1x10⁶个/只)、dclex-tgf-β1si(1x10⁶个/只)。

4)每日观察小鼠肿瘤生长情况(游标卡尺测量小鼠荷瘤直径)，记录小鼠生存率。

表4dclex-tgf-β1si疫苗的保护性免疫效应

表4中，pbs:pbs缓冲液；dc:未结合外泌体的树突状细胞；dclex：lex致敏的树突状细胞；dclex-gfp:lexgfp致敏的树突状细胞。dclex-tgf-β1si：lextgf-β1si致敏的树突状细胞。

由表4可见，经dclex-tgf-β1si疫苗免疫的小鼠，接种肿瘤后，其肿瘤发生率较dclex和dclex-gfp疫苗免疫组显著降低。

本发明中涉及的序列如下表5所示：

表5本发明中涉及的序列

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

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