本发明属于微生物
技术领域：
。更具体地，本发明涉及一株改善肝功能的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum，l.plantarum)zy001及其在发酵乳中的应用。
背景技术：
：新疆喀什地区具有优越的草资源条件和种植业丰富的秸秆资源，拥有驴品种、数量资源优势，为驴产业发展创造了得天独厚的条件。2008年，新疆驴被列为国家级畜禽遗传资源保护品种。驴奶作为驴养殖业的主要副产品之一，不仅具有较高的营养价值，而且具有较广泛的药用价值。其它奶源相比，驴奶是一种低脂肪、低胆固醇、高钙、富硒、美容、抗衰老的天然乳品，驴奶中各营养成分的比例最为接近人乳。驴奶中含有大量的表皮细胞生长因子(egf)，egf能增强人体的免疫力、抵抗力；可以促进上皮细胞营养代谢，保护皮肤及预防皮肤由于各种原因导致的损失，有促进皮下胶原细胞再生功能。国内外临床研究表明，益生乳酸菌可逆转肠内菌群失衡，当肠道粘膜组织受损严重，增加富含修复肠上皮细胞的特殊营养物质，如多糖类益生元，药食同源功能组分等，对恢复肠道功能有确切的增益作用，可减少肠源性感染和器官功能衰竭的发生率，是扭转疾病急性转危的关键环节，从而降低病死率；同时可减少抗生素的使用与住院时间，降低医疗费用，微生态营养治疗已为疾病治疗打开一扇新窗口。植物乳杆菌是乳酸菌的一种，常存在于发酵的蔬菜和果汁中，在食品、青贮饲料及医疗保健等领域受到越来越多的关注。该菌株属于同型发酵乳酸菌，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、l-山梨糖、乳糖、纤维二糖、木糖、蜜二糖、果糖、核糖、葡萄糖酸钠产酸，但发酵葡萄糖和葡萄糖酸钠均不产气。利用该菌株发酵乳糖产酸处理乳清中乳糖转化时，具有其他菌种无法比拟的优越性，它既可以高转化率地利用乳糖转化为葡萄糖，又可以利用乳清中残留蛋白质。本发明的特色是：1、菌种来源于新疆喀什地区，从新疆土法驴酸奶中分离得到的乳酸菌；2、植物乳杆菌作为人体肠道中的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡，提高机体免疫力和改善肝功能等多种功能；3、cn104770469a提供的产品方案为以纯驴奶或加入其他不含酪蛋白的天然产物提取物水溶液的驴奶为原料发酵生产酸奶制品，其中由于驴奶酪蛋白含量低的原因不能实现酸奶的制备，可归为乳酸饮料的一种。本发明的酸奶制备过程是以植物乳杆菌或植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌以1～3∶1～2∶1配比配制发酵种子，接种至驴奶∶牛奶＝2～4∶8～6的混合乳原料中，发酵获得凝乳型驴奶发酵乳产品。技术实现要素：[要解决的技术问题]本发明的目的是提供一株改善肝功能的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum，l.plantarum)zy001。本发明的另一个目的是提供所述的植物乳杆菌zy001在发酵乳中的应用。[技术方案]本发明是通过下述技术方案实现的。本发明涉及一株植物乳杆菌zy001，该菌株已于2016年09月02日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为cgmcc13505。根据本发明的一种优选实施方式，所述的乳类发酵制品是发酵乳。根据本发明的一种优选实施方式，植物乳杆菌zy001及其在发酵乳中的应用制备步骤如下：(1)从新疆土法驴酸奶中分离得到乳酸菌zy001，经鉴定是植物乳杆菌，即植物乳杆菌zy001；(2)以驴奶和牛奶混合乳为原料，接种植物乳杆菌zy001发酵获得单菌驴奶发酵乳；(3)以单菌驴奶发酵乳灌胃酒精肝损伤sd大鼠，测定谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)含量，确定植物乳杆菌zy001改善肝功能的功效；(4)将植物乳杆菌zy001、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌以1～3∶1～2∶1配比配制发酵种子，接种至驴奶∶牛奶＝2～4∶8～6的原料中，发酵获得驴奶发酵乳产品。步骤(2)中所述的发酵温度为42℃，发酵终点为ph4.0，即凝乳时间；步骤(3)中所述动物模型每组10只，分别为空白组、生理盐水对照组、植物乳杆菌zy001发酵乳实验组及混合乳组；给予方式为灌胃；以自动血液生化分析仪测定生化指标血清中谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)的活性。本发明方案的实施，至少具有以下优势：根据本发明方法，发酵菌种分离于肝病发病率较低的新疆喀什地区的土菌发酵驴奶，经动物实验证实，该菌具有一定的改善肝功能功效。本发明的应用主原料之一为驴奶，驴奶具有增强免疫力，美容、抗衰老的功效，经植物乳杆菌zy001发酵后，更易被人体吸收、代谢，发酵产品具备驴奶和植物乳杆菌zy001的双重功效。与cn106190930a不同的是本发明提供的菌种为自行分离的拥有自主知识产权的菌种，已进行专利保藏；与cn104770469a相比，本发明提供的产品为真正意义上的发酵乳品，呈凝乳状。具体实施方式下面将结合具体实施例来进一步对本发明作详细描述，以使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚。以下实施例仅用于举例说明，并不对本发明构成任何限制。实施例1植物乳杆菌zy001是从新疆牧民家庭自然发酵酸驴奶中分离、筛选出的一株具有优良发酵特性的植物乳杆菌。将zy001划线接种至mrs琼脂培养基，42℃培养24h，在该条件下进行连续传代培养25代，未见显著性变异。挑取zy001菌落，画线接种于mrs液体培养基上，在温度37℃与厌氧的条件下培养48h；待菌落形成后，以1％的接种量接种mrs液体培养基，37℃条件下扩大培养24h；再次画线于mrs琼脂培养基上，确认其为纯培养物后穿刺于mrs半固体培养基上，4℃下保存。观察记录纯培养物的菌落形态、革兰氏染色细胞形态特征，并进行常规的接触酶和氧化酶实验。将革兰氏阳性、接触酶和氧化酶试验阴性和细胞形态呈杆状的菌株暂时命名为乳杆菌。该菌株在mrs培养基上形成浅黄色的圆形菌落凸起，表面光滑，细密，在显微镜下观测的细胞多为细长杆状。本发明使用的mrs琼脂培养基由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g柠檬酸合硫酸镁、20g葡萄糖、1ml吐温80、5g兰水合乙酸纳、2g三水合磷酸氢二钾、0.58g七水合硫酸镁、0.25g一水合硫酸锰、6g琼脂与1000ml蒸馏水组成，其ph6.2-6.6。本发明使用的mrs液体培养基是由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g柠檬酸氢二胺、20g葡萄糖、1ml吐温80、5g三水合乙酸纳、2g三水合磷酸氢二钾、0.58g七水合硫酸镁、0.25g一水合硫酸锰与1000ml蒸馏水组成，其ph6.2-6.6。以mrs液体培养基重量计2％的接种量，将分离纯化的菌种在37℃条件下扩大培养，接着对菌种培养物进行碳水化合物产酸(api50ch)反应，鉴定菌种的理化性质。用试剂盒提取菌种dna，设计16srdna和phes基因序列的引物并进行pcr反应及测序。经过16srdna和phes基因序列同源性比对，所述菌株与lactobacillusplantarumwcfs1(sequenceid：nc_004567.2)有99％的同源性。经过对多项实验数据的综合分析，鉴定菌株zy001为植物乳杆菌。表1为菌种zy001细胞形态和生理生化鉴定结果。实施例2：将活化的植物乳杆菌zy001接种于mrs液体培养基，37℃培养24h，以4％接种量接种纯牛奶，42℃静置培养至凝乳，充分搅拌后，取凝乳发酵液以4％接种量接种至驴奶∶牛奶＝3∶7的混合乳中，42℃培养至凝乳，获得植物乳杆菌zy001发酵乳，凝乳时间为12h，凝乳时ph为4.0。获得植物乳杆菌zy001发酵乳及配置的未发酵的混合乳用于后续动物实验。实施例3：大鼠建酒精性肝损伤模型将40只sd大鼠(雌雄各半)机分为模型组和空白组，体重180-200g，在温度22-24℃，湿度30-40％，光照和黑暗时间为12h的环境中饲养，正常对照组与模型组动物一样给予基础饮食，模型组按0.2ml/100g体质量的剂量灌胃50％的乙醇溶液12ml/kg*bw，每天1次；正常对照组给予等体积蒸馏水，持续30天后，以自动血液生化分析仪测定生化指标血清中谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)的活性。将建模成功的sd大鼠随机分组，每组10只，分别为空白组、生理盐水对照组、植物乳杆菌zy001发酵乳实验组及混合乳组；给予方式为灌胃，灌胃量5ml/次，每日2次，2周后以自动血液生化分析仪测定生化指标血清中谷草转氨酶(ast)和谷丙转氨酶(alt)的活性，结果见表2。经动物实验发现，以单菌驴奶发酵乳灌胃乙醇肝损伤sd大鼠，可显著改善ast和alt的表达，由此可见，植物乳杆菌zy001具备改善肝功能的功效。实施例4：驴奶发酵乳的制备以驴奶和牛奶混合乳为原料，底物配比2∶8，3∶7，4∶6。分别活化培养公司前期保存鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌以及植物乳杆菌zy001，将三种菌于mrs培养基中37℃培养24h后，4％接种于无菌纯牛奶，42℃静置培养至凝乳后按植物乳杆菌zy001、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌＝1∶1∶1，1∶2∶1，2∶1∶1，2∶2∶1；3∶1∶1，3∶2∶1各种配比接种驴奶牛奶混合乳(2-4∶8-6)，42℃静置培养至凝乳，获得不同配比的驴奶发酵乳产品。表1菌种zy001细胞形态和理化实验结果表注：+表示阴性反应；-表示阴性反应。图1菌种zy00116srdna基因序列测序结果atacatgcagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagttatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaaggtgggacagatgattagggtgaagtcgtaacaag图2菌种zy001phes基因序列测序结果aagacgtgctactacgcacgcagacgtctgctgatcagccgcggtcacttgaaaatcacgatttttctaaaggaccgctgaaggtcttgtcacctggccgcgtttatcggcgtgatacggatgatgcaacccattcccatcaatttcatcaaattgaagggttagtcgtggacaagcatattacgatggctgatttgaagggcaccttaattctggttgccaagactttgtttggcgatcaattcgagtttcggctacggccaagcttctttccattcacggaaccatccgtagaagctgatgtaacttgctttaattgcaatggcaagggctgtgcaatctctaagcaaacgggttggatcgaagtactgggtgccggcatggttcacccccacgtgttagaaatgtctggcattgatccagaagaatatggtggctttgctttcgggcctagg表2发酵乳对酒精性肝损伤大鼠模型的酶指标组别ast(u/l)alt(u/l)正常组19.82±4.3226.21±4.38模型组51.21±6.3846.89±6.34生理盐水对照组50.76±4.7545.86±5.56混合乳组45.25±6.7841.77±7.18植物乳杆菌zy001发酵乳实验组36.53±6.7536.45±6.17当前第1页12