与鹌鹑产蛋性状相关的SNP遗传标记及应用的制作方法

本发明属于家禽的分子标记制备技术领域，具体涉及一种与鹌鹑产蛋性能相关的遗传标记及应用。该遗传标记克隆自eed基因的一个片段，可应用于鹌鹑标记辅助选择育种。

背景技术：

鹌鹑是一种特种经济禽类，具有极高的食用价值和食疗功效。随着人们生活水平的提高，对鹌鹑蛋的需求量越来越大。目前饲养的蛋用鹌鹑品种多表现为产蛋性能较低、蛋重大小不均匀等缺点，培育高产性能的鹌鹑品种成为目前鹌鹑育种与养殖领域的研究重点之一。通过表型选择等常规育种方法进行产蛋性能的遗传改良，所需时间长、成本高；随着分子生物学技术的发展，利用分子标记辅助选择并结合传统育种方法已经成为目前加快畜禽品种选育的主要方法之一。因此，筛选与鹌鹑产蛋性状基因座相连锁的分子遗传标记，应用于分子标记辅助选择培育蛋用鹌鹑新品种，是目前及今后一段时间鹌鹑分子生物学领域的研究重点之一。

胚胎外胚层发育基因(embryonicectodermdevelopment,eed)是pcg蛋白家族的成员之一。pcg蛋白家族是一类重要的转录抑制因子，与细胞增殖相关的调控基因启动子区结合(piuntietal,2011)，可偶联dna特异序列结合因子、信号转导调控因子等，动态调控细胞周期、靶基因表达、衰老等(laietal，2013)。作为pcg蛋白家族的成员，eed基因在细胞增殖、性成熟启动中发挥着重要的作用，但目前关于eed基因在畜禽上的研究还较少，仅见少量研究结果表明，eed基因在哺乳动物的器官发生中发挥作用(morin-kensickietal，2001)，初步表明eed转录抑制因子与鸡性成熟启动相关(盛中伟等，2016)。然而关于eed基因进一步的功能及其在其他家禽中的研究还未见报道。

综合所述，eed基因与家禽性成熟启动密切相关，研究性成熟启动的调节机制对于家禽高产品种的育种具有重要意义。通过研究基因突变位点在群体中的多态性，并进行性状的关联分析是发掘与特定性状相关的分子标记、研究基因功能的重要手段之一。鉴于此，申请人克隆了鹌鹑eed基因外显子8-9部分序列，并进行了该序列的多态性及其与鹌鹑产蛋性状的关联分析研究，为鹌鹑的遗传改良提供了重要的理论支持。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于获得与鹌鹑产蛋性状相关的snp分子标记及在鹌鹑上的应用。从鹌鹑eed基因克隆得到一个特异的dna片段(外显子8-9部分片段)，分析该片段与鹌鹑产蛋性状的相关性，本发明为鹌鹑的标记辅助选择育种提供一种新的遗传标记。

为了实现本发明的目的，本发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种与与鹌鹑产蛋性状相关的snp遗传标记，通过对鹌鹑eed基因外显子8-9区域的分离克隆，发现了一种与鹌鹑产蛋性状相关的snp分子标记，该标记的核苷酸序列如seqidno:1所示，序列长度为605bp，其中在该序列所示的“r”(即第187bp处的碱基突变)是a或g(即存在一个a/g替换)、“y”(即第208bp处的碱基突变)是t或c，(即存在一个t/c替换)，采用直接测序的方法进行上述位点的检测。

申请人设计了一种扩增鹌鹑eed基因和检测该基因片段突变的引物对，该引物对的dna序列如下所示：

正向引物：5’-ttgggtgacctaattctt-3’，与seqidno:2所示的序列对应。

反向引物：5’-tttgactcacttggcttg-3’，与seqidno:3所示的序列对应。

本发明建立了一种与鹌鹑产蛋性状相关的遗传标记的制备方法，按照以下步骤进行制备：

从鹌鹑血液中提取dna，根据鹌鹑eed基因序列设计引物，该引物对的dna序列如序列表seqidno:2和seqidno:3所示，用序列表seqidno:2和seqidno:3所示的引物在鹌鹑基因组dna中进行pcr扩增，pcr产物经纯化、克隆测序后，获得如序列表seqidno:1所示的核苷酸序列。

本发明的遗传标记可用于鹌鹑产蛋性状检测中，其中所设计的引物对也可应用于鹌鹑产蛋性状的检测中。

本发明与现有技术相比，本发明具有如下优点和显著的进步：(1)利用本发明中发现的分子标记，在蛋用鹌鹑育种群体中增加at/gc单倍型个体的选择，可以使鹌鹑的开产适当提前，增加at/ac单倍型个体的选择会提高选育群体的产蛋量，同时选择这两种单倍型的个体，可以提前选育群体的开产日龄同时提高产蛋量；(2)实现了对鹌鹑产蛋性状进行早期选择，检测方法快速、准确，且不受养殖环境条件因素影响，并可缩短育种周期、降低育种成本。

附图说明

图1：本发明pcr扩增获得的eed基因部分序列的琼脂糖凝胶电泳图，琼脂糖浓度为2％，图中标记说明：1-6为泳道编号，m是ds^tm2000marker。

图2：本发明中鹌鹑eed基因外显子8-9区域部分序列直接测序检测到的突变位点测序峰图比较结果，其中(a)为187bp突变位点测序峰图比较结果，(b)为208bp突变位点的测序峰图比较结果。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1eed基因部分基因组序列的获得及多态性检测方法的建立

1、引物设计

根据鹌鹑eed基因序列(genbankaccessionno.nc_029516)，设计该基因外显子8-9的引物序列如下：

正向引物f：5’-ttgggtgacctaattctt-3’

反向引物r：5’-tttgactcacttggcttg-3’

以蛋用鹌鹑为试验群体，提取鹌鹑的血液基因组dna，并以此dna为模板扩增鹌鹑eed基因部分序列片段。

2、pcr扩增条件

利用上述引物在鹌鹑基因组dna中进行pcr扩增，pcr反应总体积15μl，体系中各组分的浓度为：鹌鹑基因组dna约100ng，1×taqbuffer，1.5mmol/lmgcl2，dntp2.5mmol/l，引物终浓度为0.2μmol/l，2utaqdna聚合酶。pcr扩增程序是:预变性95℃5min，然后再循环34次94℃30s，53℃35s，72℃45s，最后72℃延伸10min。pcr反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，结果如图1，1-6泳道分别为eed基因外显子8-9区域部分个体的扩增结果，m为markerds^tm2000，扩增的结果均可用于进一步的分析中。

3、pcr产物的纯化

上述pcr产物用北京天根生化技术有限公司生产的凝胶回收纯化试剂盒进行切胶纯化，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，称重；

(2)向胶块中加入等倍体积的溶液pn，50℃水浴放置10分钟至胶完全溶解，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，吸附柱放回收集管；

(4)向吸附柱中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心30-60秒，弃废液。

(5)重复步骤4；

(6)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2分钟。室温放置数分钟彻底晾干吸附柱。

(7)将吸附柱放入一干净的离心管中，向吸附柱膜中间加入洗脱缓冲液，室温放置2分钟后，12,000rpm离心1分钟收集纯化产物。

4、利用pcr产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的pcr纯化产物直接送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，直接从测序色谱图(图2)上进行基因型分析。

实施例2本发明制备的遗传标记在鹌鹑群体中的分布情况

申请人在黄羽系和栗羽系2个蛋用鹌鹑群体中检测了鹌鹑eed基因外显子8-9区两个等位基因的分布频率，检测结果如表1所示，结果表明：在第187bp处的g/a多态性分布，在黄羽系群体中a等位基因占主要优势，而在栗羽系群体中g等位基因占主要优势，且杂合型个体所占比最大，但两个群体中等位基因频率分布差异不显著；在第208bp处的t/c多态性分布，在黄羽和栗羽两个群体中均表现为t等位基因占主要优势，且两个群体中均为tt基因型所占比例最大。

表1eed基因外显子8-9区多态在不同鹌鹑群体中的分布

实施例3本发明制备的遗传标记与鹌鹑产蛋性状关联分析及应用

1、单倍型的构建

将上述利用pcr-直接测序法得到的所有个体的两个多态位点的基因型数据输入haploview软件，计算得到每个个体的单倍型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度，用标准化的连锁不平衡系数d’表示。结果发现两个位点之间的连锁不平衡系数d’等于1，即为完全连锁不平衡。共有4种单体型ac、at、gc和gt，其所占等位基因的频率分别为22.73％、27.27％、12.5％和37.5％，构成5种单体型组合ac/ac、at/ac、at/gc、at/gt、gt/gt。

2、单体型组合与蛋用鹌鹑产蛋性状的关联分析

申请人在蛋用鹌鹑群体(来自湖北神丹健康食品有限公司)528个具有完整生产数据的个体中分析本发明制备的遗传标记与鹌鹑产蛋性状的相关关系。所分析的产蛋性状主要包括开产日龄、开产体重、蛋重、蛋品质、20周龄体重及20周龄产蛋数等。采用实施例1所建立的pcr-直接测序方法进行个体的基因分型，采用spss统计软件(statisticalpackageforthesocialsciences,version18.0)一般线性模型进行统计分析，其中除了随机效应以外，其他因素均为固定效应。

关联分析的结果见表2。由表中可以看出，单倍型不同时，开产日龄、蛋重和20周产蛋数等性状存在显著差异(p<0.05)；其中，单倍型为at/gc的个体开产日龄和蛋重显著高于其他4种单倍型(p<0.05)，单倍型为at/ac的个体20周龄产蛋数显著高于其他4种单倍型(p<0.05)。由此可以看出，at/gc单倍型个体开产更早、蛋重较大，而at/ac单倍型个体20周龄产蛋数最多，在育种实践中，可以根据不同的育种目标选择不同的单倍型个体进行育种。

表2eed基因内外显子8-9区多态与产蛋性状的关联分析

注：标有不同上标字母a、b、c表示差异显著(p<0.05)；n表示个体数。

seqidno:1

<110>湖北省农业科学研究院畜牧兽医研究所

<120>与鹌鹑产蛋性状相关的snp遗传标记及应用

<160>3

<210>1

<211>605

<212>dna

<400>1

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