本发明涉及环境微生物
技术领域：
，具体而言，涉及一种微生物混合菌剂的制备方法、微生物混合菌剂及其应用。
背景技术：
：土壤是人类赖以生存的重要自然资源之一，也是人类生态环境的重要组成部分。随着工业、城市污染的加剧和农药化肥的施用，含重金属的污染物通过各种途径进入土壤，造成土壤中重金属的累积。重金属污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性的特点，我国环保部门和各级政府部门加大了对各地区环境中重金属含量的现状的统计和监管，并针对各地区不同的情况，在重金属污染产生的各个阶段给予监控，并选择适合本地区的行之有效的修复措施。重金属污染防治工作已经成为我国环境保护工作的重中之重，党和国家高度重视重金属污染问题，2016年5月国务院颁发《土壤污染防治行动计划》(土十条)，开启了我国修复治理农田污染的新阶段。因此，重金属污染治理技术必将成为今后一段时期内重金属污染领域的热点内容。近年来，我国土壤重金属污染进入集中多发期，据农业部进行的全国污灌区调查，在约140万公顷的污水灌区中，遭受重金属污染的土地面积占污水灌区面积的64.8％，其中轻度污染的占46.7％，中度污染的占9.7％，严重污染的占8.4％。我国土壤重金属污染状况已经影响到耕地质量、食品安全甚至人的身体健康。目前，修复重金属污染土壤主要有两种途径。一是利用超富集植物吸收土壤中的重金属，收割植物从而减少土壤中重金属含量；二是通过钝化或固化改变土壤中重金属的赋存形态，减少其在土壤中的迁移性和可利用性。利用超富集植物修复技术周期长而且占用大量的农田，不适宜在污染农田大面积推广。现有的用于重金属污染土壤处理的固化剂主要以磷酸盐为主，磷酸盐复合的固化剂稳定效果一般，而且过量的磷酸盐会引起土壤ph变化，以及富营养化等环境问题。微生物修复技术引起了国内外学者的广泛关注。微生物能够通过自身的吸附、富集、分泌代谢产物如草酸、亚硫离子、磷酸盐等会与重金属形成沉淀，从而降低土壤中重金属的生物可利用性。具有溶磷能力的微生物能够将土壤中难溶性磷酸盐中的磷酸根离子释放出来，可以很好地实现重金属的固定。微生物修复技术不仅降低了修复成本，而且不会引起土壤ph变化造成金属元素的淋溶和富营养化等问题。但现有的微生物土壤修复剂中含有的微生物特性不明，在施用后不能适应重金属污染土壤的环境，从而存活率低，影响钝化效果。其微生物的含量低，过半为有机料腐熟剂、磷石膏粉、草炭粉等制成的有机堆肥，制备方法复杂而且成本增加。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种微生物混合菌剂的制备方法，其从土壤浸提液中获取，并通过重金属离子的驯化，该制备方法操作简单、方便。本发明的另一目的在于提供一种微生物混合菌剂，其能够使土壤中的重金属钝化，使土壤中的有效态重金属离子含量降低，降低种植的农作物的重金属含量；同时，能够提高土壤中可溶性磷的含量，从而促使农作物的生长。本发明的第三目的在于提供上述微生物混合菌剂在修复重金属污染土壤中的应用，能够使土壤中的重金属钝化，使土壤中的有效态重金属离子含量降低，降低种植的农作物的重金属含量。本发明的第四目的在于提供上述微生物混合菌剂在溶解难溶性磷酸盐方面的应用，能够提高土壤中可溶性磷的含量，从而促使农作物的生长。本发明是采用以下技术方案实现的：一种微生物混合菌剂的制备方法，将土壤浸提液接种于lb培养基中得到微生物菌群，将微生物菌群接种于含有重金属离子的有氮改良培养基中进行驯化处理。一种微生物混合菌剂，由上述微生物混合菌剂的制备方法制得。上述微生物混合菌剂在修复重金属污染土壤中的应用。上述微生物混合菌剂在溶解难溶性磷酸盐方面的应用。本发明提供的微生物混合菌剂的制备方法、微生物混合菌剂及其应用的有益效果为：在土壤浸提液中获得，并通过了重金属离子的驯化处理得到微生物混合菌剂，其制备方法简单，操作方便，需要的环境条件温和，适于工业推广和应用。微生物混合菌剂能够使土壤中的重金属钝化，使土壤中的有效态重金属离子含量降低，降低种植的农作物的重金属含量；同时，能够提高土壤中可溶性磷的含量，从而促使农作物的生长。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的微生物混合菌剂的制备方法、微生物混合菌剂及其应用进行具体说明。微生物混合菌剂的制备方法为：将土壤浸提液接种于lb培养基中得到微生物菌群，微生物混合菌剂从土壤浸提液中获取。其中，向重金属污染土壤中加水后在震荡速度为120-160r/min的条件下震荡25-35min，取上层清液获得土壤浸提液。土壤浸提液是在重金属污染土壤中获得，并经过lb培养基培养以后获得微生物菌群，说明微生物菌群中的菌株均能够在重金属污染的条件下存活。优选地，取20g的重金属污染土壤于装有20ml无菌水的锥形瓶中，在震荡速度为140r/min室温条件下震荡30min获得土壤浸提液。土壤浸提液以1％-3％的比例接种至lb培养基中，在温度为33-37℃、震荡速度为120-160r/min的摇床培养20-30h得到微生物菌群。其中，lb培养基包括8-12g/l的胰蛋白胨、4-6g/l的酵母提取物和8-12g/l的氯化钠，lb培养基的ph值为7.0-7.2，在温度为115-125℃的条件下高温湿热灭菌15-25min。优选地，lb培养基包括10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物和10g/l的氯化钠，在121℃条件下高温湿热灭菌20min。将微生物菌群接种于含有重金属离子的有氮改良培养基中进行驯化处理得到微生物混合菌剂。微生物菌群经过了重金属离子的驯化处理，提高其在重金属污染土壤中的存活能力。优选地，将微生物菌群以任意顺序依次接种于含有cd2+、zn2+、pb2+、ni2+、cr6+的有氮改良培养基中进行驯化处理得到微生物混合菌剂。使微生物混合菌剂可以在含有cd2+、zn2+、pb2+、ni2+、cr6+等重金属离子的条件下存活。更佳地，将微生物菌群接种于含有cd2+的有氮改良培养基中进行第一次驯化处理得到第一微生物菌群，将第一微生物菌群接种于含有zn2+的有氮改良培养基中进行第二次驯化处理得到第二微生物菌群，将第二微生物菌群接种于含有pb2+的有氮改良培养基中进行第三次驯化处理得到第三微生物菌群，将第三微生物菌群接种于含有ni2+的有氮改良培养基中进行第四次驯化处理得到第四微生物菌群，将第四微生物菌群接种于含有cr6+的有氮改良培养基中进行第五次驯化处理得到微生物混合菌剂。第一微生物菌群在cd2+重金属污染的条件下有很强的生存能力，第二微生物菌群在cd2+和zn2+重金属污染的条件下有很强的生存能力，第三微生物菌群在cd2+、zn2+和pb2+重金属污染的条件下有很强的生存能力，第四微生物菌群在cd2+、zn2+、pb2+和ni2+重金属污染的条件下有很强的生存能力，微生物混合菌剂在cd2+、zn2+、pb2+、ni2+和cr6+重金属污染的条件下有很强的生存能力。微生物混合菌剂能够承受各种重金属离子，在多种重金属离子污染的土壤中均能够存活。类似的实施方式可以是：将微生物菌群接种于含有zn2+的有氮改良培养基中进行第一次驯化处理得到第一微生物菌群，将第一微生物菌群接种于含有ni2+的有氮改良培养基中进行第二次驯化处理得到第二微生物菌群，将第二微生物菌群接种于含有cd2+的有氮改良培养基中进行第三次驯化处理得到第三微生物菌群，将第三微生物菌群接种于含有pb2+的有氮改良培养基中进行第四次驯化处理得到第四微生物菌群，将第四微生物菌群接种于含有cr6+的有氮改良培养基中进行第五次驯化处理得到微生物混合菌剂。其中：微生物菌群还可以按照其他顺序依次接种于cd2+、zn2+、pb2+、ni2+和cr6+这五种重金属离子的有氮改良培养基中进行驯化处理。优选地，将微生物菌群培养液以5％-15％的比例接种至含重金属(cd2+、zn2+、pb2+、ni2+和cr6+)的有氮改良培养基中，在33-37℃震荡速度为120-160r/min的条件下培养36-60h，并逐步提升培养基中重金属的浓度至菌群的几乎无法生长。然后，将上述得到的经cd2+驯化之后的微生物菌群继续用其他的重金属(zn2+、pb2+、ni2+和cr6+)进行驯化。将经过多种重金属驯化的微生物菌群以10％的比例接种至含cd2+、zn2+、pb2+、ni2+和cr6+的有氮改良培养基中继续驯化，并逐步提升重金属的浓度至菌群几乎无法生长。能够在培养基中生存的细菌即为耐受多种重金属的细菌，即耐受重金属的混合菌株，即为微生物混合菌剂。其中，有氮改良培养基包括8-12g/l的蔗糖、1-3g/l的磷酸氢二钾、0.2-0.8g/l的硫酸镁、0.5-1.5g/l的硫酸铵、0.05-0.15g/l的氯化钠、0.2-0.8g/l的酵母膏和0.2-0.8g/l的碳酸钙，其中，有氮改良培养基的ph值为7.0-7.2，在温度为115-125℃的条件下高温湿热灭菌15-25min得到有氮改良培养基。优选地，有氮改良培养基包括10g/l的蔗糖、2g/l的磷酸氢二钾、0.5g/l的硫酸镁、1g/l的硫酸铵、0.1g/l的氯化钠、0.5g/l的酵母膏和0.5g/l的碳酸钙，在121℃条件下高温湿热灭菌20min。微生物混合菌剂由上述微生物混合菌剂的制备方法制得。将微生物混合菌剂和40wt％的甘油以1：1-1：1.5体积比进行混合后，放置于-80℃的条件下进行冻存。本发明实施例还提供了上述微生物混合菌剂在修复重金属污染土壤中的应用。其能够使土壤中的重金属钝化，使土壤中的有效态重金属离子含量降低，降低种植的农作物的重金属含量。重金属为cd、zn、pb、ni和cr中的一种或几种，微生物混合菌剂不仅能够在含有重金属的条件下生存，而且其联合作用对cd、zn、pb、ni和cr都具有很好的钝化效果，降低土壤内的有效态重金属的含量，从而降低农作物对土壤内的重金属的吸收，提高种植的农作物的品质。其具体的方法为：在重金属污染土壤中接种微生物混合菌剂，并加水，使重金属污染土壤中的含水量为60wt％-70wt％并保持20-30天，使污染土壤中的重金属钝化。本发明实施例还提供了上述微生物混合菌剂在溶解难溶性磷酸盐方面的应用。能够提高土壤中可溶性磷的含量，从而促使农作物的生长。土壤浸提液中的微生物会有一定的差异，但通过上述方法获得的微生物混合菌剂中的菌株均能表现出较强的钝化土壤中重金属的能力，并具有一定的溶解难溶性磷酸盐的能力。实施例1首先，将8g/l的胰蛋白胨、4g/l的酵母提取物和8g/l的氯化钠，并在温度为115℃、ph值为7.0的条件下高温湿热灭菌15min得到lb培养基。其次，将8g/l的蔗糖、1g/l的磷酸氢二钾、0.2g/l的硫酸镁、0.5g/l的硫酸铵、0.05g/l的氯化钠、0.2g/l的酵母膏和0.2g/l的碳酸钙，并在温度为115℃、ph值为7.0的条件下高温湿热灭菌15min得到有氮改良培养基。取20g的重金属污染土壤于装有20ml无菌水的锥形瓶中，震荡速度为120r/min的条件下震荡25min获得土壤浸提液。土壤浸提液以1％的比例接种至lb培养基中，在温度为37℃、震荡速度为140r/min的摇床培养24h得到微生物菌群。将微生物菌群以10％的比例接种于含有cd2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为140r/min的条件下第一次驯化48h得到第一微生物菌群，将第一微生物菌群以10％的比例接种于含有zn2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为140r/min的条件下第二次驯化处理48h得到第二微生物菌群，将第二微生物菌群以10％的比例接种于含有pb2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为140r/min的条件下第三次驯化处理48h得到第三微生物菌群，将第三微生物菌群以10％的比例接种于含有ni2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为140r/min的条件下第四次驯化处理48h得到第四微生物菌群，将第四微生物菌群以10％的比例接种于含有cr6+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为140r/min的条件下第五次驯化处理48h得到微生物混合菌剂。实施例2首先，将12g/l的胰蛋白胨、6g/l的酵母提取物和12g/l的氯化钠，并在温度为125℃、ph值为7.2的条件下高温湿热灭菌25min得到lb培养基。其次，将12g/l的蔗糖、3g/l的磷酸氢二钾、0.8g/l的硫酸镁、1.5g/l的硫酸铵、0.15g/l的氯化钠、0.8g/l的酵母膏和0.8g/l的碳酸钙，并在温度为125℃、ph值为7.2的条件下高温湿热灭菌25min得到有氮改良培养基。取20g的重金属污染土壤于装有20ml无菌水的锥形瓶中，震荡速度为160r/min的条件下震荡35min获得土壤浸提液。土壤浸提液以3％的比例接种至lb培养基中，在温度为35℃、震荡速度为120r/min的摇床培养20h得到微生物菌群。将微生物菌群以5％的比例接种于含有zn2+的有氮改良培养基中，在33℃震荡速度为120r/min的条件下第一次驯化36h得到第一微生物菌群，将第一微生物菌群以15％的比例接种于含有pb2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为160r/min的条件下第二次驯化处理60h得到第二微生物菌群，将第二微生物菌群以10％的比例接种于含有ni2+的有氮改良培养基中，在35℃震荡速度为140r/min的条件下第三次驯化处理48h得到第三微生物菌群，将第三微生物菌群以10％的比例接种于含有cr6+的有氮改良培养基中，在35℃震荡速度为140r/min的条件下第四次驯化处理48h得到第四微生物菌群，将第四微生物菌群以10％的比例接种于含有cd2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为140r/min的条件下第五次驯化处理48h得到微生物混合菌剂。实施例3首先，将10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物和10g/l的氯化钠，并在温度为120℃、ph值为7.1的条件下高温湿热灭菌20min得到lb培养基。其次，将10g/l的蔗糖、2g/l的磷酸氢二钾、0.5g/l的硫酸镁、1g/l的硫酸铵、0.1g/l的氯化钠、0.5g/l的酵母膏和0.5g/l的碳酸钙，并在温度为120℃、ph值为7.1的条件下高温湿热灭菌20min得到有氮改良培养基。取20g的重金属污染土壤于装有20ml无菌水的锥形瓶中，震荡速度为140r/min的条件下震荡30min获得土壤浸提液。土壤浸提液以2％的比例接种至lb培养基中，在温度为37℃、震荡速度为160r/min的摇床培养30h得到微生物菌群。将微生物菌群以10％的比例接种于含有pb2+的有氮改良培养基中，在35℃震荡速度为140r/min的条件下第一次驯化48h得到第一微生物菌群，将第一微生物菌群以10％的比例接种于含有ni2+的有氮改良培养基中，在35℃震荡速度为140r/min的条件下第二次驯化处理48h得到第二微生物菌群，将第二微生物菌群以5％的比例接种于含有cr6+的有氮改良培养基中，在33℃震荡速度为120r/min的条件下第三次驯化处理36h得到第三微生物菌群，将第三微生物菌群以15％的比例接种于含有cd2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为160r/min的条件下第四次驯化处理60h得到第四微生物菌群，将第四微生物菌群以10％的比例接种于含有zn2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为140r/min的条件下第五次驯化处理48h得到微生物混合菌剂。实施例4首先，将10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物和10g/l的氯化钠，并在温度为120℃、ph值为7.1的条件下高温湿热灭菌20min得到lb培养基。其次，将10g/l的蔗糖、2g/l的磷酸氢二钾、0.5g/l的硫酸镁、1g/l的硫酸铵、0.1g/l的氯化钠、0.5g/l的酵母膏和0.5g/l的碳酸钙，并在温度为120℃、ph值为7.1的条件下高温湿热灭菌20min得到有氮改良培养基。取20g的重金属污染土壤于装有20ml无菌水的锥形瓶中，震荡速度为140r/min的条件下震荡30min获得土壤浸提液。土壤浸提液以1％的比例接种至lb培养基中，在温度为35℃、震荡速度为140r/min的摇床培养24h得到微生物菌群。将微生物菌群以15％的比例接种于含有ni2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为160r/min的条件下第一次驯化60h得到第一微生物菌群，将第一微生物菌群以5％的比例接种于含有cr6+的有氮改良培养基中，在33℃震荡速度为120r/min的条件下第二次驯化处理36h得到第二微生物菌群，将第二微生物菌群以15％的比例接种于含有cd2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为160r/min的条件下第三次驯化处理60h得到第三微生物菌群，将第三微生物菌群以5％的比例接种于含有zn2+的有氮改良培养基中，在33℃震荡速度为120r/min的条件下第四次驯化处理36h得到第四微生物菌群，将第四微生物菌群以10％的比例接种于含有pb2+的有氮改良培养基中，在37℃震荡速度为140r/min的条件下第五次驯化处理48h得到微生物混合菌剂。试验例对实施例1-4提供的微生物混合菌剂吸附重金属离子的能力进行检测：将微生物混合菌剂以1％的比例接种至lb液体培养基中，在37℃、震荡速度为140r/min下培养14h进行活化。将活化的微生物混合菌剂分别以2％的比例接种于浓度为50mg/l重金属离子cd2+的lb液体培养基、浓度为50mg/l重金属离子zn2+的lb液体培养基、浓度为50mg/l重金属离子pb2+的lb液体培养基、浓度为50mg/l重金属离子ni2+的lb液体培养基和浓度为50mg/l重金属离子cr6+的lb液体培养基中，后在37℃下以140r/min的速度在摇床中培养3天，然后在室温下以5000r/min的速度离心20min，收集上清液，利用火焰原子吸收光谱法对上清液中的重金属浓度进行检测，检测以后得到表1。表1微生物混合菌剂吸附重金属离子能力的测定结果从表1可以看出，溶液中的重金属离子浓度下降了20-25％，说明微生物混合菌剂对重金属离子具有钝化效果。对实施例1-4提供的微生物混合菌剂的溶解难溶性磷酸盐方面的检测：首先准备溶液，钼锑贮存液的制备方法为：将153ml浓硫酸(分析纯)，缓慢加入到400ml蒸馏水中，不断搅拌，冷却；称取磨细的钼酸铵((nh4)6mo7o2·4h2o)10g，溶于温度约60℃的300ml水中，冷却；将硫酸溶液缓慢倒入钼酸铵溶液中，加入0.5％酒石酸锑钾100ml，冷却后定容至1000ml，贮存于棕色瓶中，此贮备液含钼酸铵1％、硫酸2.75mol/l。钼锑抗显色剂：称取1.5g抗坏血酸溶于100ml钼锑贮存液，现配现用。nbrip液体培养基的制备方法为：将10g/l葡萄糖、5g/l磷酸三钙/磷酸铝、10g/l氯化镁、0.25g/l七水硫酸镁、0.2g/l氯化钾和0.1g/l硫酸铵混合，其初始ph值为7.0，在115℃高温湿热灭菌30min得到。将实施例1-4提供的微生物混合菌剂以1％的比例接种至lb液体培养基中，在37℃、震荡速度为140r/min下培养14h进行活化。将活化的微生物混合菌剂分别以2％的比例接种至nbrip液体培养基中，添加等量无菌水作为对照组，28℃下以160r/min的速度振荡培养5天，利用钼锑抗显色法对菌株的溶磷能力进行检测，得到表2。表2微生物混合菌剂的溶磷能力的测定结果对照组实施例1实施例2实施例3实施例4有效磷/mg/l1.37120.13125.72124.49129.58从表2可以看出，微生物混合菌剂具有很强的溶解难溶性磷酸盐的能力，将其接种于土壤中，能够提高土壤中可溶性磷的含量，从而促使农作物的生长发育。实施例1-4提供的微生物混合菌剂修复重金属污染土壤的效果测定：将重金属污染土壤自然风干以后，充分混合均匀以后置于花盆中，微生物混合菌剂以1％的比例接种至lb液体培养基中，在37℃、震荡速度为140r/min下培养14h进行活化。将活化的微生物混合菌剂按照5wt％的比例接种至花盆中，不接种微生物混合菌剂为对照组，充分混合均匀，并定期浇水，保持重金属污染土壤的含水量为60wt％-70wt％，定期搅拌混合均匀并保持20天，取湿润土壤，利用tclp和cacl2法提取土壤中有效态的重金属离子，利用火焰原子吸收光谱法测定其浓度，检测以后得到表3。(其中，可以根据重金属污染土壤中的重金属含量适当添加活化的微生物混合菌剂的接种比例至10wt％)表3微生物混合菌剂修复重金属土壤的测定结果对照组实施例1实施例2实施例3实施例4cd2+/mg/kg0.390.2730.2640.2470.234zn2+/mg/kg20.3913.01814.27313.2812.234pb2+/mg/kg6.694.4214.0144.6834.218ni2+/mg/kg8.355.8455.6065.3685.01cr6+/mg/kg12.577.9428.3898.2718.485从表3可以看出，重金属污染土壤中的有效态重金属浓度下降了30-40％，说明微生物混合菌剂对重金属污染土壤中的重金属具有很好的钝化效果，使重金属污染土壤中的活性金属降低。实施例1-4提供的微生物混合菌剂降低农作物中重金属的效果测定：将实施例1-4提供的微生物混合菌剂以1％的比例接种至lb液体培养基中，在37℃、震荡速度为140r/min下培养14h进行活化。将活化的微生物混合菌剂按5wt％的比例分别接种至含重金属污染的供试土壤的花盆中，充分混匀，室温放置一周，定期浇水，保持含水量为土壤持水量的60wt％-70wt％。还设置对照组，即不接种微生物混合菌剂，其他条件相同，选取大小均匀的油菜种子经95％酒精和3％naclo溶液表面灭菌并用无菌水冲洗之后，将种子分别放入花盆中培育，每个花盆种植10株。定期浇水，保持光照时间为12-14小时，作物生长40天后收获，分别测定油菜的重量以及油菜茎的重金属含量，并求其平均值，检测以后得到表4。表4微生物混合菌剂降低油菜中重金属的测定结果对照组实施例1实施例2实施例3实施例4cd2+/mg/kg0.930.5580.430.5410.372zn2+/mg/kg30.3416.86612.13618.20413.742pb2+/mg/kg3.451.381.611.842.07ni2+/mg/kg2.250.91.081.351.17cr6+/mg/kg16.739.0388.6929.3210.031油菜重量/g215240.8245.96243.38256.28从表4可以看出，与对照组相比，接种微生物混合菌剂后种植的油菜的重量均有不同程度的提升，且重金属含量均低于对照组，油菜中重金属含量与对照组相比降低了40-60％，说明微生物混合菌剂的使用能够促进从而促使油菜的生长，降低油菜的重金属含量，(其中，本发明的农作物不仅是油菜，还可以是印度芥菜、豌豆、大白菜、萝卜和黑麦草等)。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12