烟粉虱MED隐种高温耐受相关基因特异性探针及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及烟粉虱med隐种高温耐受相关基因特异性探针及其应用。

背景技术：

烟粉虱(bemisiatabaci(gennadius))属节肢动物门，昆虫纲，半翅目，粉虱科，小粉虱属，又称棉粉虱或甘薯粉虱。

烟粉虱的最适发育温度为26～30℃，发育临界温度在10.8～12.5℃之间，致死高温区在37～42℃之间。17℃和35℃是烟粉虱正常生长发育的最低和最高的温度极限。较强的温度逆境适应能力是烟粉虱在世界范围内广泛分布的原因。随着温室效应的增加，全球气温正逐年增高，烟粉虱较强的温度逆境适应能力使其能逐渐扩大保护地面积，这为其抵御温度逆境、延续种群提供给了场所。

通过基因的mrna原位杂交可以解析基因在烟粉虱中定位和表达模式，有助于更深入了解目的基因的作用机制。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种烟粉虱med隐种高温耐受相关基因的特异性探针。

本发明的再一目的是提供上述烟粉虱med隐种高温耐受相关基因的特异性探针的应用。

根据本发明的具体实施方式，烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3，该基因cdna全长核苷酸序列如seqidno.1所示，其编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。btdnmt3基因的表达直接降低了med隐种对高温耐受性的能力。

根据本发明的具体实施方式，所述烟粉虱med隐种高温耐受相关基因的特异性探针通过以引物f：tccaaacacatttcgtcaag和r：tcgcaaataagaactactcctc扩增烟粉虱med隐种高温耐受相关基因btdnmt3的cdna序列而得。

本发明还提供了上述特异性探针在原位杂交中的应用。

根据本发明的具体实施方式，使用上述烟粉虱btdnmt3基因的特异性探针进行原位杂交的方法包括以下步骤：

(1)根据btdnmt3的cdna序列设计btdnmt3特异的探针序列，以cdna为模板，设计的f和r引物进行普通pcr产物扩增，f：tccaaacacatttcgtcaag

r：tcgcaaataagaactactcctc；

(2)合成btdnmt3的mrna原位杂交的探针，并将探针标记上地高辛；

(3)检测btdnmt3的mrna探针的原位杂交。

本发明的有益效果是：本发明的mrna探针可以与组织中btdnmt3基因的mrna发生特异性的结合，从而方便准确的观察到组织中btdnmt3基因mrna水平的变化。本发明的btdnmt3的探针序列，对btdnmt3基因mrna的显示有明确的特异性，实现了对btdnmt3基因mrna水平的显示作用。可以将本发明的特异性探针直接用于成虫进行原位杂交，省去了制作切片步骤，可以降低实验的复杂性，减少实验步骤，且具有较高的敏感度，有利于更方便快捷的检测目的基因在虫体的定位表达。

附图说明

图1显示根据本发明实施例的烟粉虱btdnmt3基因在雄虫中的mrna原位表达的示意图，箭头所指位置是生殖部位。

图2显示根据本发明实施例的烟粉虱btdnmt3基因在雌虫中的mrna原位表达的示意图，箭头所指位置是生殖部位。

具体实施方式

实施例1：烟粉虱med隐种btdnmt3基因全长cdna序列克隆

分别取不同温度胁迫条件下烟粉虱成虫200头放入1.5ml的离心管，液氮冷冻后利用研磨棒将其研成粉末，然后提取rna，-80℃保存以备用。以cdna为模板，利用以下引物，pcr扩增烟粉虱med隐种btdnmt3基因的中间片段。

btdnmt3-f：ctactgctaaactccattcgc

btdnmt3-r：ctctgaaacacggtagtccc

根据所获得的烟粉虱med隐种btdnmt3基因的中间片段序列，设计5’race和3’race特异性引物，pcr扩增btdnmt3基因的5’和3’端序列：

5’raceinnerprimer:ggaacctctgaaacacggtagtccccaa

5’raceouterprimer:ttgtgacacgcagtgacttcagtgataggt

3’raceinnerprimer:taaccaccaatccaaattccttgcggc

3’raceouterprimer:tggtttggggactaccgtgtttcagagg

获得btdnmt3基因的cdna序列全长,得到btdnmt3基因4512bp序列，所得的基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，包含653个核苷酸，该基因所编码的酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。

实施例2：btdnmt3基因的表达特性分析

对btdnmt3进行不同组织的表达谱分析，实时荧光定量pcr结果表明，btdnmt3在头部、胸部和腹部中均有表达，且在腹部显著高表达。

对btdnmt3进行不同发育阶段的表达谱分析，实时荧光定量pcr结果表明，btdnmt3在卵期、一龄、二龄、三龄、四龄、伪蛹、成虫中具有表达。成虫之前，在卵期高表达，后表达量逐渐降低，到成虫再次高表达。

饲喂btdnmt3基因dsrna的烟粉虱med隐种的击倒时间显著低于饲喂dsegfp组和蔗糖组的击倒时间(p<0.05)；同时在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)blast显示，所饲喂的靶序列片度为btdnmt3基因特有的序列，由此确保了干扰效果为烟粉虱med隐种的目的btdnmt3基因所产生，因此，说明btdnmt3基因在烟粉虱med隐种高温耐受性中起着关键作用。

实施例3原位杂交

1、烟粉虱btdnmt3基因的特异性mrna原位杂交探针

(a)以cdna为模板，设计的f和r引物进行普通pcr产物扩增，f：tccaaacacatttcgtcaag；r：tcgcaaataagaactactcctc，

并对产物进行切胶回收与纯化，用pgem-teasy感受态细胞，对纯化后的pcr产物进行克隆并测序。将测序序列进行比对分析，所得克隆片段为目的基因的片段；

(b)挑取经测序验证的阳性克隆，按照axyprep质粒dna小量试剂盒中的说明进行操作，提取重组质粒；

(c)对重组质粒进行酶切，采用的酶是sacⅱ。取酶切产物加入苯酚：氯仿：异丙醇混合物(25:24:1)，剧烈震荡1min后，4℃条件下12000rpm离心10min；转移上清至无核酸酶的离心管中，加1/10体积的3m醋酸钠，加2倍体积的冰无水乙醇轻轻混匀，-20℃静置2.5小时后，4℃条件下14000rpm离心30min；弃上清液，用1ml80％的乙醇洗涤沉淀，反复颠倒洗涤沉淀，4℃条件下14000rpm离心10min；弃乙醇，风干沉淀，加入depc-h2o，溶解沉淀，获得线性化质粒。

(2)将纯化后的产物标记上非放射性标记物-地高辛。

(3)将探针纯化。

加2uldnasei，37℃反应15min，去除未反应完全的dna模板；再加0.8ul0.5medta(ph＝8.0)终止反应；加1/10体积的3m醋酸钠，加2.5倍体积(125ul)冰冷的无水乙醇，-70℃冰箱放置过夜，取出后，4℃条件下14000rpm离心10min；弃上清液，用1ml75％的乙醇洗涤沉淀，反复颠倒洗涤沉淀，4℃条件下14000rpm离心10min；弃上清液，风干沉淀，加入depc-h2o，溶解沉淀，获得纯化后的目的探针。

(4)检测btdnmt3的mrna探针的原位杂交

(4-1)样本搜集：在显微镜下分别挑取烟粉虱雌雄成虫置于事先加入200ul1×pbs缓冲液的1.5ml无核酶的离心管中，用枪头轻轻地反复吸打冲洗，然后吸出1×pbs缓冲液，将虫体留于管中；

(4-2)取材后虫体的固定：加入1ml卡诺氏固定液，在4℃条件下固定12h；

(4-3)虫体的漂洗：移走上一步骤中的液体，保留虫体于离心管中。加入200ul的50％乙醇进行摇洗，洗三次，每次5min；

(4-4)移走上一步骤中的液体，加入200ul的1×pbs-1％tritonx-100溶液，30℃摇洗30min；

(4-5)虫体的褪色：移走上一步骤中的液体，加入1ml的6％h2o2的乙醇溶液，室温下褪色2h；随后，移走上一步骤中的液体，加入200ul的50％乙醇进行摇洗，洗三次，每次5min；

4-(6)虫体的透化：移走上一步骤中的液体，加入200ul蛋白酶k，在56℃水浴条件下透化30min；随后，移走上一步骤中的液体，加入200ul的50％乙醇进行摇洗，洗三次，每次5min；

(4-7)虫体的再固定：移走上一步骤中的液体，加入1ml的4％多聚甲醛固定液固定液，在4℃条件下固定30min；随后，移走上一步骤中的液体，加入200ul的50％乙醇进行摇洗，洗三次，每次5min；

(4-8)虫体的预杂交：移走上一步骤中的液体，加入200ul的预杂交缓冲液，在55℃条件下预杂交15min；

(4-9)虫体的杂交：移走上一步骤中的液体，加入300ul事先预热的杂交液(探针浓度为5ng/ul),55℃℃避光孵育过夜。

(4-10)杂交后清洗：移走上一步骤中的液体，将虫体置于一系列用2×ssc溶液配制的不同浓度的预杂交液进行处理，且在杂交温度下进行。具体过程如下：分别于预杂交液：2×ssc＝2:1、1:1、1:2的浓度配比下的溶液中各处理15min；后于2×ssc溶液中处理10min；

(4-11)虫体的封闭：移走上一步骤中的液体，加入200ul按照1:5000的比例用anti-dig-ap于1×blockingreagent中的封闭液，在4℃条件下封闭过夜；

(4-12)移走上一步骤中的液体，加入200ul的1×pbs进行摇洗，洗三次，每次30min；随后，移走上一步骤中的液体，加入200ul的ap缓冲液，静置2次，每次10min；

(4-13)虫体的显色：移走上一步骤中的液体，在黑暗条件下，加入300ul的hnpp/fastred：ap＝1:1：100显色液，室温显色30min；

(4-14)封片：待显色后，移走显色液，终止反应，加入200ul的1×pbs进行摇洗，洗三次，每次5min；

(4-15)固定拍照：将虫体用80％甘油固定，于digitalmicroscopevhx-2000下进行观察并拍照。

由图1、图2可见btdnmt3在烟粉虱胸部和腹部均有表达，且在腹部靠近生殖部位表达量较强。

<110>中国农业科学院植物保护研究所

<120>烟粉虱med隐种高温耐受相关基因特异性探针及其应用

<160>2

<210>1

<211>4512

<212>dna

<213>烟粉虱

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