本发明涉及药物化学技术领域，具体为一种3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂及其制备方法和用途。本发明也涉及制备目标化合物的中间体化合物。
背景技术：
微管蛋白是一类含有多个成员的蛋白质家族，包括α、β、γ、δ、ε、ζ、η七种微管蛋白。其中，α-微管蛋白和β-微管蛋白是构成微管的主要成分。微管是真核细胞的主要骨架成分，在维持细胞形态、蛋白质转运、信号传导和有丝分裂过程中起到关键作用，因此成为了治疗癌症的一个有效的靶点。而作用于微管蛋白的微管靶向药物，成为近年来进行较多研究的有效的抗肿瘤药物。已知的微观蛋白抑制剂通过至少四个结合位点与微管蛋白相互作用，分别是laulimalide、紫杉醇/埃博霉素、长春碱和秋水仙碱位点。与已经成功用于癌症临床治疗的紫衫醇类和长春碱类相比，秋水仙碱(colchicine)本身虽然是有效的化合物，但在有效药物浓度下被其对正常组织的的毒性所限制，仅被批准用于家族性地中海、发烧和急性痛风治疗。研究发现，作用于秋水仙碱位点的抑制剂通过阻止新血管生成或者破坏肿瘤现有的脉管系统阻止微管聚合，破坏肿瘤细胞的骨架，从而阻断肿瘤的血液供给，使肿瘤细胞因缺乏营养而凋亡。另外，由于秋水仙碱位点在微管蛋白中所占体积较小，且相应抑制剂的结构较为简单，此类微管蛋白抑制剂的研究成为一个新方向。
许多微管蛋白抑制剂是基于天然产物而得到的。combretastatin一族是pettit小组从南非植物combretumcaffrum中分离出来的天然化合物。combretastatina-4(ca-4)是已知的具有强效抑制微管蛋白活性和细胞毒性的天然微管蛋白抑制剂。研究证明，ca-4通过与秋水仙碱竞争微管蛋白上的结合位点来达到抑制微管蛋白的聚合。虽然ca-4具有广谱的体外抗肿瘤活性，但由于水溶性差，生物利用度低，且在储存和体内代谢过程中其顺式活性构型容易异化成无活性的反式构型，限制了它在临床上的广泛应用。直到20世纪90年代，ca-4的磷酸盐化极大的改善了这些性质，使其进入了更深入的临床试验。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂，以微管蛋白中的秋水仙碱结合位点为靶标。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述化合物的中间体化合物。
本发明还提供具有良好抗肿瘤活性的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供一种3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂，其具有通式i所示结构：
其中：r1是h,f,cl,br,oh,ch3,och3,no2,och2ch3或och(ch3)2,r2是ch3，och3，och2ch3或och(ch3)2，且r1为h时，r2不为och3。优选的r1为h或f,r2为och3，或者och2ch3。更优选的，r1为h，同时r2为och2ch3；或者r1为f，同时r2为och3。
本发明还提供一种上述的微管蛋白抑制剂的制备方法，其化学反应方程式如下：
具体步骤如下：
(1)在催化剂三氟乙酸银的存在下，将碘单质溶于有机溶剂中，在室温下避光,与式1所示取代苯酚类化合物反应获得式2所示碘化产物；
(2)将式2所示碘化产物在乙酸酐和有机碱的作用下进行乙酰化，获得式3所示的乙酰化产物；
(3)将式3所示的乙酰化产物在碱、pd(pph3)2cl2和cui的作用下，与4-r2取代苯乙炔发生sonogashira偶联反应，惰性气氛保护，95～105℃的温度下下反应5～7小时得式4所示的偶联产物；
(4)碱性条件下，将式4所示的偶联产物溶于甲醇中，加热回流可得式5所示苯并呋喃类化合物；
(5)将式5所示苯并呋喃类化合物溶于无水二氯甲烷中，在无水四氯化锡作用下，与3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯发生傅克酰基化反应，得到通式i所示结构的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂。
上述步骤(2)中，有机碱为吡啶；步骤(3)中，采用的碱为三乙胺；步骤(4)中，所用的碱为碳酸钾。
上述步骤(3)中，式3所示乙酰化产物、4-r2取代苯乙炔、碱、pd(pph3)2cl2和cui的投料摩尔比为1:1.3:2:0.05:0.05。
上述步骤(5)中，式5所示苯并呋喃类化合物、3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯和无水四氯化锡的投料摩尔比为1:1.2:1。
本发明进一步提供一种用于制备3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂的中间体化合物，其具有如式4所示的结构：
其中：r1是h,f,cl,br,oh,ch3,och3,no2,och2ch3或och(ch3)2,r2是ch3，och3，och2ch3或och(ch3)2，且r1为h时，r2不为och3。优选的，r1为h或f,r2为och3，或者och2ch3。
本发明还进一步提供上述的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂在制备肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌和乳腺癌药物方面的用途。
和现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明合成的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂具有优秀的微管蛋白抑制活性，作用机制与秋水仙碱相似，能够抑制微管蛋白聚合。
本发明合成的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂，对人肺癌细胞a549，人胃癌细胞mgc-803，人肝癌细胞hepg2，人结肠癌细胞hct-116，人宫颈癌细胞hela，人乳腺癌细胞mcf-7有很强的增殖抑制活性。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
核磁共振1hnmr,13cnmr,19fnmr由布鲁克avanceiii型500mhz核磁共振仪测定，使用氘代cdcl3或氘代dmso作溶剂，tms为内标，化学位移δ单位为ppm，耦合常数j的单位为hz。高分辨质谱由brukersolarix70ft-ms测定。
本发明主要针对3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂进行设计与合成。首先利用计算机辅助药物设计，通过模型建立、分子对接、分子动力学模拟手段得到新化合物的模拟结果，其中最具参考价值的是运用分子动力学模拟等方法得到的化合物与微管蛋白复合物的吉布斯结合自由能。就combretastatina-4而言，其结合自由能的预测值为-37.57±2.62kcal·mol-1(文献：med.chem.commun.,2014,5,766-782)，以之为参考，本发明实施例中设计出结合自由能更小的新化合物：结构式1和结构式2其结合自由能结果分别为-43.45、-42.03kcal·mol-1。结合自由能的结果越小，则说明化合物的活性可能更高。
实施例1：结构式1化合物的制备
(1)250ml用锡纸包裹的圆底烧瓶中，i2(5.1g,20.0mmol)溶于氯仿(150ml)，并搅拌超过1.5小时。另，化合物式1(r1＝h)(20.0mmol)置入250ml用锡纸包裹的圆底烧瓶，加入三氟乙酸银agotfa(4.5g,20.0mmol)。将氯仿溶液缓慢(约2-3小时)加入锡纸包裹的烧瓶中，反应室温下搅拌24小时结束。过滤，并用氯仿洗涤残渣。然后用饱和na2s2o3溶液，饱和nahco3溶液，饱和食盐水萃取，所得有机相用无水na2so4干燥。过滤，减压浓缩后进行柱层析分离(用ch2cl2作洗脱剂,柱层析避光)。得到产物，2-碘-5-甲氧基苯酚(式2，r1＝h)。白色固体，产率52.87％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.49(d,j＝9.0hz,1h),6.60(d,j＝2.5hz,1h),6.34(dd,j＝6.0,2.5hz,1h),5.31(s,1h),3.77(s,3h).
(2)将步骤(1)得到的化合物式2(r1＝h)(7.46mmol)溶于无水ch2cl2，加吡啶(1.2g,14.92mmol)，在0℃下逐滴地加乙酸酐(1.54g,14.92mmol)，然后室温避光搅拌4小时，反应结束。倒入ch2cl2，加饱和nahco3溶液，加食盐水萃取。有机相用无水na2so4干燥。减压浓缩后，用pet-ether/etoac进行柱层析分离。得到产物，2-碘-5-甲氧基乙酸苯酯(式3，r1＝h)。无色液体，产率78.55％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.66(d,j＝9.0hz,1h),6.69(d,j＝3.0hz,1h),6.60(dd,j＝6.0,2.5hz,1h),3.77(s,3h),2.36(s,3h).
(3)n2氛围下将步骤(2)所得化合物式3(r1＝h)(5.0mmol)溶于dmf(10ml)，然后加入4-乙氧基苯乙炔(950mg,6.5mmol)，三乙胺(1.02g,10.0mmol)，以及催化剂cui(50mg,0.25mmol)和pd(pph3)2cl2(175mg,0.25mmol)。加热至100℃，反应6小时。tlc跟踪反应。结束后，体系缓慢冷却至室温，用etoac和水萃取。合并有机相，无水na2so4干燥，过滤，减压浓缩后用pet-ether/etoac进行柱层析分离，得到产物：2-((4-乙氧基苯基)乙炔基)-5-甲氧基乙酸苯酯(式4，r1＝h，r2＝och2ch3)。
黄色固体，产率46.08％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.46(d,j＝8.5hz,1h),7.40(d,j＝8.5hz,2h),6.85(d,j＝8.5hz,2h),6.78(dd,j＝6.0,2.5hz,1h),6.67(d,j＝2.5hz,1h),4.05(q,j＝7.0hz,2h),3.82(s,3h),2.36(s,3h),1.42(t,j＝7.0hz,3h).13cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝168.77,160.28,159.02,152.58,133.40,132.84,115.23,114.54,112.01,109.89,108.26,92.87,82.84,63.53,55.56,20.89,14.76.esi-hrms(m/z):calculatedforc19h18o4(m+h)+,311.12386,found:311.12381.
(4)将步骤(3)得到的化合物式4(r1＝h)(1.6mmol)溶于甲醇(10ml)，溶解均匀后，加无水k2co3(553mg,4.0mmol)，加热到60℃，搅拌回流16小时。反应结束后，过量甲醇用减压旋蒸除去，得黄色固体。用etoac溶解固体，并用水萃取，无水na2so4干燥所得有机相。过滤，减压浓缩，再得黄色固体。用petether:etoac＝30:1进行柱层析可得产物，2-(4-乙氧基苯基)-6-甲氧基苯并呋喃(式5，r1＝h，r2＝och2ch3)。
白色固体，产率40.25％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.73(d,j＝9.0hz,2h),7.41(d,j＝8.0hz,1h),7.06(s,1h),6.96(d,j＝9.0hz,2h),6.86(dd,j＝6.0,2.5hz,1h),6.80(s,1h),4.09(q,j＝7.0hz,2h),3.87(s,3h),1.45(t,j＝7.0hz,3h).13cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝159.03,157.70,155.68,155.39,125.93,123.47,122.88,120.64,114.77,111.67,99.42,95.94,63.55,55.75,14.85.esi-hrms(m/z):calculatedforc17h16o3(m+h)+,268.10994,found:268.10936.
(5)将步骤(4)得到的化合物式5(r1＝h，r2＝och2ch3)(50mg)溶于无水ch2cl2(2ml)中，加入3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯(1.2eq)，然后在0℃逐滴加入无水sncl4(1.0eq)。于室温下反应3小时，tlc跟踪。反应结束时，用碎冰块淬灭，再搅拌1小时。分离出有机相，并用ch2cl2萃取水相。用无水na2so4干燥合并的有机相，过滤，减压浓缩，用pet-ether/etoac进行柱层析分离纯化，可得目标产物，2-(4-乙氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-6-甲氧基苯并呋喃(结构式1，r1＝h，r2＝och2ch3)。
黄绿色固体，产率70.76％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.55–7.53(m,3h),7.12(s,2h),7.08(d,j＝2.0hz,1h),6.91(dd,j＝6.5,2.0hz,1h),6.79(d,j＝9.0hz,2h),4.00(q,j＝7.0hz,2h),3.88(s,3h),3.86(s,3h),3.69(s,6h),1.39(t,j＝7.0hz,3h).13cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝190.90,159.99,158.50,157.34,154.69,152.86,142.39,132.68,129.84,122.21,121.99,121.70,114.54,114.35,112.60,107.42,95.65,63.55,60.93,56.10,55.76,14.66.esi-hrms(m/z):calculatedforc27h26o7(m+h)+,463.17121,found:463.17670.
实施例2：结构式2化合物的制备
(1)苯酚类原料为式1(r1＝f)，步骤同实施例1中的步骤(1)。得到产物2-碘-4-氟-5-甲氧基苯酚(式2，r1＝f)。
白色固体，产率39.92％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.31(d,j＝10hz,1h),6.67(d,j＝7.5hz,1h),5.13-5.12(m,1h),3.85(s,3h).19fnmr(470mhz,cdcl3)δ＝-143.08.13cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝151.73(d,j＝2.5hz),149.2,146.82(d,j＝240.6hz),123.70(d,j＝22.5hz),100.30,70.97(d,j＝7.5hz),56.27.esi-hrms(m/z):calculatedforc7h6fio2(m+h)+,268.94301,found:268.94769.
(2)步骤同实施例1中的步骤(2)。得到产物2-碘-4-氟-5-甲氧基乙酸苯酯(式3，r1＝f)。
白色晶体，产率81.28％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.47(d,j＝10hz,1h),6.74(d,j＝7.5hz,1h),3.85(s,3h),2.35(s,3h).19fnmr(470mhz,cdcl3)δ＝-135.80.13cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝168.57,150.05(d,j＝247.5hz),148.50(d,j＝11.3hz),147.60(d,j＝2.5hz),125.22(d,j＝21.3hz),108.28,99.99,56.43,21.15.esi-hrms(m/z):calculatedforc9h8fio3(m+h)+,310.95357,found:310.95754.
(3)步骤同实施例1中的步骤(3)。得到产物2-((4-甲氧基苯基)乙炔基)-4-氟-5-甲氧基乙酸苯酯(式4，r1＝f，r2＝och3)。
黄色固体，产率32.80％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.43(d,j＝9.0hz,2h),7.27(d,j＝11.5hz,1h),6.89(d,j＝8.5hz,2h),6.75(d,j＝7.5hz,1h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),2.37(s,3h).19fnmr(470mhz,cdcl3)δ＝-137.90.13cnmr(125hz,cdcl3)δ＝168.81,159.88,149.6(d,j＝243.8hz),148.24(d,j＝12.5hz),147.99(d,j＝3.8hz),132.94,119.00(d,j＝21.3hz),114.91,114.09,109.59(d,j＝10hz),107.86,93.63,81.94,56.38,55.31,20.77.esi-hrms(m/z):calculatedforc18h15fo4(m+na)+,337.09544,found:337.08508.
(4)后处理得到的黄色固体用正己烷，etoac洗脱，其余步骤同实施例1中的步骤(4)，可得产物2-(4-甲氧基苯基)-5-氟-6-甲氧基苯并呋喃(式5，r1＝f，r2＝och3)
白色固体，产率25.25％。1hnmr(500mhz,dmso)δ＝7.79(d,j＝9.0hz,2h),7.49(d,j＝7.0hz,1h),7.45(d,j＝11.0hz,1h),7.17(s,1h),7.06(d,j＝8.5hz,2h),3.90(s,3h),3.82(s,3h).19fnmr(470mhz,dmso)δ＝-140.21.13cnmr(125mhz,dmso)δ＝160.05,156.03,150.84,149.80(d,j＝236.3hz),145.83(d,j＝13.8hz),126.29,122.96,121.40(d,j＝10.0hz),115.00,107.03(d,j＝22.5hz),100.68,97.60,56.93,55.74.esi-hrms(m/z):calculatedforc16h13fo3(m+h)+,273.08823,found:273.09217.
(5)步骤同实施例1中的步骤(5)，得到目标产物2-(4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-5-氟-6-甲氧基苯并呋喃(结构式2，r1＝f，r2＝och3)。
黄绿色固体，产率70.07％。1hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.50(d,j＝8.5hz,2h),7.38(d,j＝10.5hz,1h),7.14(d,j＝6.5hz,1h),7.08(s,2h),6.79(d,j＝8.5hz,2h),3.94(s,3h),3.85(s,3h),3.76(s,3h),3.68(s,6h).19fnmr(470mhz,cdcl3)δ＝-138.74.13cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝190.41,160.76,158.10,152.91,150.58(d,j＝240hz),149.85,146.81(d,j＝13.8hz),142.60,132.39,129.92,122.14,120.79(d,j＝8.8hz),114.74(d,j＝3.8hz),113.90,107.60,107.42,96.29,60.93,56.61,56.12,55.32.esi-hrms(m/z):calculatedforc26h23fo7(m+h)+,467.14614,found:467.15066.
实施例3：抗增殖实验
1.实验方法
取活细胞比例达90％以上的细胞进行实验。细胞增殖抑制试验采用enogenecelltmcountingkit-8(cck-8)细胞活力检测试剂盒。细胞消化、计数、制成浓度为1×105个/ml的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μl细胞悬液(每孔1×104个细胞)；96孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养24小时；每孔加入100μl相应的含药物的培养基，同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳性对照组，每组5复孔；96孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养72小时后；每孔加入10μlcck-8溶液,将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的od值，计算结构式1、结构式2以及ca-4阳性对照对人肺癌细胞a549、人结肠癌细胞hct-116、人宫颈癌细胞hela、人肝癌细胞hepg2、人胃癌细胞mgc-803、人乳腺癌细胞mcf-7等细胞的抑制率及ic50值。
2.实验结果
表1本发明化合物和阳性对照ca-4(combretastatina-4)对不同肿瘤细胞的抑制活性
在本发明化合物结构式1、结构式2和阳性对照ca-4对6种癌细胞的抗肿瘤活性中，化合物结构式1表现出了除hepg2细胞外，与阳性对照ca-4相当的抑制活性。结构式1的抑制活性是ca-4活性的12.2倍，超过一个数量级。化合物结构式2，在a549、hela细胞的抑制活性上与ca-4相当，在hct-116、mgc-803和mcf-7细胞的抑制活性比ca-4要差，仅在hepg2细胞的抑制活性上是ca-4活性的3.8倍。结构式1对六种癌细胞的抑制活性都比结构式2的活性要好。除hepg2细胞外，结构式1对其余5种癌细胞的抑制活性是结构式2活性的5倍还要多。说明本发明的有益效果在于制备的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂对癌症细胞有着强效的增殖抑制活性。
实施例4：微管蛋白聚合实验
1.实验方法
抑制微管蛋白聚合活性测试由济南华维医药科技有限公司采用猪脑微管蛋白进行抑制活性测试。
2.实验结果
表2本发明化合物和阳性对照ca-4对微管蛋白抑制活性
从表2可以看到本发明化合物结构式1的微管蛋白抑制活性为0.86μm，与阳性参照ca-4的活性(0.88μm)相当。化合物结构式2的微管蛋白活性则超过了200μm。说明本发明的有益效果在于制备的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃类微管蛋白抑制剂具有优秀的微管蛋白抑制活性。