一种基因VII型新城疫弱病毒株的制作方法

本发明属于疫苗用病毒株筛选技术领域，具体涉及一种基因vii型新城疫弱病毒株。

技术背景

新城疫是由新城疫病毒引起的一种急性烈性传染病，对养禽业的危害极大，曾经被国际兽疫局(oie)列为a类病。nd于1926年首先被发现于印度尼西亚爪哇，同年发现于英国的纽卡斯尔城，此后迅速向世界各地传播。目前nd已在世界范围内发生了四次大流行，并且宿主范围不断扩大。

刘秀梵等对1985‐2003年分离自江苏浙江地区的29株新城疫病毒进行序列分析，结果显示有17株属于基因vii型，其中10株分离自发病鹅群。刘华雷等对2005年分离自中国大陆地区的83株新城疫病毒进行分析显示，其中64株属于基因vii型。lien等对2003‐2006年间分离自台湾地区的20株新城疫病毒均为基因vii型。此外同阶段中国周边的韩国和日本流行的ndv也大都为基因vii型。我们对本实验室近年分离的部分ndv毒株也进行了测序分析，结果显示，70％以上的毒株为基因vii型。由此看出，基因vii型新城疫病毒在中国禽群中广泛流行，是目前的绝对优势基因型。

当前市场上对新城疫病毒的防控主要使用iv系疫苗株lasota、clone30和ii系疫苗株b1等基因ii型的毒株，它们虽然可以提供一定的免疫保护，但是不能完全阻止新城疫病毒的传播、扩散，特别是基因vii型新城疫病毒的流行给养殖业造成了巨大的经济损失。由于流行的基因vii型新城疫病毒都是强毒，因此大多数毒株不适合作为疫苗株使用，除非是自然弱毒株或是基因工程手段人工致弱的毒株。获得弱毒株是生产疫苗的关键。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基因vii型新城疫弱病毒株，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种基因vii型新城疫病毒弱毒株wf株，其于2017年3月7日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:v201708；

所述的wf株的p蛋白的第237位和第240位氨基酸发生了突变，其中第237位为苏氨酸(t)，第240位为异亮氨酸(i)。

上述wf株用于制备疫苗；

所述的疫苗，优选为灭活疫苗。

本发明通过自然筛选别获得的疫苗侯选株wf株，通过做成疫苗免疫动物后发现，均能诱导产生较高的中和抗体，能抵抗强毒力基因vii型新城疫病毒的侵害，有广阔的应用前景。

附图说明

图1：新城疫f基因片段pcr鉴定图；

图2：ndv毒株(wf株、sl株)基于f基因片段的系统发生树；

图3：新城疫9个基因片段pcr鉴定结果图；

图4：全基因组分段构建pcr鉴定结果图；

图5：np、p、l辅助质粒酶切鉴定图。

具体实施方式

本发明通过对临床分离的两株基因vii型ndv进行研究，发现一株为中等偏弱毒力毒株(wf株)，一株为强毒株(sl株)；通过对它们的基因组测序，并与ncbi公布的基因vii型ndv的p基因进行大量比对，发现wf株在p蛋白的第237位和第240位氨基酸与其它毒株不同，推测其可能与新城疫的毒力有关。按照wf株的p蛋白的序列对sl株的p基因进行改造，结果获得了一株高度致弱的基因vii型新城疫疫苗侯选株。分别研究wf株和改造后的sl株的生物学特性，并分别做成灭活苗免疫动物后，能提供很好的免疫保护效果；从而促成了本发明。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1基因vii型ndv野毒株的筛选及序列分析

从临床发病鸡中分离到两株疑似ndv毒株，接种鸡胚收取尿囊液，测定ha效价。根据ncbi公布的ndv的f基因序列设计引物，鉴定新城疫毒株。上游引物：ndvf‐f：atgggctccaaaccttctaccag；下游引物：ndvf‐r：aaactgctgcatcttcccaaccg。

取收取的尿囊液250ul按常规方法提取rna，反转录。以ndvf‐f/ndvf‐r为引物扩增f基因的部分片段，片段大小约500bp。核酸电泳后，切取阳性条带，回收，连接t载体测序。取f基因47nt‐420nt之间的序列绘制基因进化树，分析分离毒株的基因型。用于试验分析的毒株genbank登录号为：1‐2(ay935499)、1‐2(ay935500)、18719‐03(gq288385)、b1(nc_002617)、hb92(ay225110)、herts(ay741404)、italien(eu293914)、js‐07(fj766527)、lasota(af077761)、na‐1(dq659677)、paramyxovirus‐1(aj880277)、zj1(af431744)、mukteswar(ef201805)。

结果显示，两株分离毒株为新城疫病毒，f基因裂解位点的氨基酸序列均为¹¹²r-r-q-k-r-f¹¹⁷，符合强毒株的特征，进一步的基因进化分析显示它们为基因vii型毒株。ha效价测定显示，两株病毒鸡胚尿囊液的效价分别稳定在2⁹和2⁷‐2⁸。分离的ndv毒株分别命名为wf株和sl株。其中基因vii型新城疫病毒弱毒株wf株，其于2017年3月7日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:v201708。

实施例2新城疫sl株和wf株mdt、icpi的测定

mdt是指最小致死量所能使鸡胚死亡的平均时间，mdt低于60h为强毒力ndv毒株；mdt值在60h‐90h之间为中等毒力毒株；mdt大于90h的为弱毒株。用无菌生理盐水将新鲜收获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10^‐6、10^‐7、10^‐8和10^‐94个稀释度，分别接种10日龄鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚尿囊腔内注射0.1ml。每天上午和下午各照胚一次，记录每一鸡胚的死亡时间，连续观察7日。(结果见表1)mdt计算公式为：

icpi是指1日龄雏鸡脑内致病指数。取1日龄spf雏鸡15只，各脑内注射10^‐1稀释的新鲜含毒尿囊液0.05ml。另取5只以同样方法注射相同剂量的无菌生理盐水各0.05ml作为对照。接种后，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡。

观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常为0，发病为1，死亡为2)累计总分数。

icpi为累计总分除以正常、发病和死亡动物的累计总数的平均值(结果见表1)。

表1：wf株和sl株mdt、icpi的测定

上述结果显示，sl株符合强毒株的特征，与f基因裂解位点的强毒株特性一致；而wf株的f基因裂解位点虽然也符合强毒株的特征，但表1结果表明wf株属于中等偏弱毒株，证明新城疫的毒力不仅仅与f蛋白有关，推测可能还与其它蛋白如p蛋白等有关。

实施例3：新城疫wf株、sl株全基因组序列的测定

为了确定是否p蛋白也产生了变异，根据ncbi公布的ndv基因序列，设计9对引物，相邻扩增片段之间有部分核酸序列相互重叠。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表2。

表2扩增ndvsl株全基因组的引物序列

常规方法提取病毒rna，反转录，上述引物进行pcr扩增，连接pmd19‐t载体测序，测的的序列在ncbi网站比对，用lasergene软件拼接，获得wf株和sl株全基因序列。

结果显示，wf株和sl株基因组全长15192bp，与lasota等毒株相比，在第1646‐1647位碱基之间都有多余的6个碱基，符合基因vii型新城疫毒株的特性。

进一步将wf株和sl株的p基因与ncbi公布的其它基因vii型新城疫病毒的p基因进行比对发现，wf株的p蛋白的第237位和第240位氨基酸与其它毒株有差异，其它毒株包括sl株p蛋白第237位和240位的氨基酸均为k/r和k，而wf株的p蛋白分别为t和i(其氨基酸序列为seqidno:1，其编码基因的核苷酸序列为seqidno:2)。

实施例4：基因vii型新城疫病毒致弱株的构建

通过反向遗传操作技术验证wf株p蛋白的变异是否就是导致wf株成为弱毒株的原因所在。反向遗传操作技术一般是指通过构建病毒的基因组cdna克隆，在培养细胞或/和易感宿主中重新“复活”病毒，通过基因插入或缺失等方法修饰病毒的基因组序列，以此来进行病毒的功能基因组研究和新型疫苗的研制。本实施例的ndv的拯救过程是将构建的全基因组cdna克隆(转录载体)和分别含np、p和l基因的辅助质粒(表达载体)共转染细胞，在辅助质粒提供有关酶的作用下，cdna克隆进行转录和各基因的表达，最终组装成有感染性的病毒粒子，然后通过接种鸡胚来大量扩增病毒而获得拯救的ndv。拯救出的ndv基因组最终来源于cdna克隆。

下面对具体的步骤进行描述。

1)表达t7rna聚合酶的细胞系的构建

挑取大肠杆菌bl21单个克隆，试管摇菌，取400ul菌液，13000rpm/min离心10分钟，去上清；用超纯水重悬后离心，去上清；用100ul的超纯水重悬，煮沸10min，冰浴10min；离心，取上清作为dna模板。根据ncbi公布的bl21菌株t7rna聚合酶基因序列，设计引物：t7‐f：5'ctgctcgagccaccatgaacacgattaacatcgctaagaacgac3'，t7‐r：5'ctgtctagattacgcgaacgcgaagtccgactctaagatgt，上游引物含xhoi酶切位点，下游引物含xbai酶切位点。以制备的dna作为模板进行pcr扩增，扩增片段大小约2.6kb。

取5ulpcr产物进行核酸电泳鉴定，若条带正确，将剩余的pcr产物用核酸纯化试剂盒进行纯化。纯化产物与真核表达载体pci‐neo一起进行xbai/xhoi双酶切反应。回收阳性条带，用t4dnaligase进行连接。转化，质粒的小量提取，酶切鉴定等按常规方法进行。阳性质粒送上海生工生物工程有限公司测序，获得重组质粒pci‐t7。

用含10％胎牛血清的dmem培养基培养df1细胞，均匀接种于60mm的dish培养皿，待细胞长至70％‐90％时转染。取2ug的pci‐t7重组质粒，按磷酸钙转染试剂盒说明书的要求转染df1细胞。转染后4h换成新鲜的不含g418的生长培养基，24h后换成含400ng/mlg418的生长培养基。初次传代换成含600ng/mlg418的生长培养基，以后传代逐渐提高g418的浓度，直至g418的浓度达到1mg/ml。细胞连续传代20代，提取rna，用dna酶处理后反转录，用引物t7‐f/t7‐r扩增，鉴定t7rna聚合酶的表达情况。

经鉴定，构建的细胞系可稳定传代，并且转染获得的t7rna聚合酶基因可持续表达。将构建的稳定表达t7rna聚合酶的细胞系命名为df1‐t7。

2)sl株全长cdna克隆载体的构建

根据测得的sl株全基因组序列，用oligo7软件分析其酶切位点。，将全基因组分成7段，分段连接到经过改造的载体pbrt上。其中，将p基因中第710位和719位碱基突变改造后再进行连接，构建的全长cdna克隆载体命名为pbrt-ndv-p，测序正确后，保存备用。在构建的pbrt-ndv-p载体基础上，将第3段中f基因代表强毒株特性的碱性氨基酸裂解位点突变为低致病性特征的序列，构建的全长cdna克隆载体命名为pbrt-ndv，测序正确后，保存备用。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表3。其中cl2‐t1/cl2‐t2/cl2‐t3/cl2‐t4为f基因突变引物，cl2‐2f/cl2‐t5/cl2‐t6/cl2‐2r为p基因突变引物。

表3：ndv全基因组载体构建用引物序列

3)辅助质粒的构建

分别在sl株np、p和l基因的上下游引入酶切位点，pcr扩增后酶切，连接经相同内切酶处理过的pci‐neo载体，测序后保存，分别命名为pci‐np、pci‐p和pci‐l。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表4。

表4：ndv辅助质粒构建用引物序列

4)病毒拯救

df1‐t7细胞接种于35mm六孔板内生长至70％‐80％单层时，将转录质粒pbrt‐ndv‐p及辅助质粒pci‐np、pci‐p和pci‐l分别以5ug、2.5ug、1.25ug、1.25ug的比例，共转染df1‐t7细胞系，采用磷酸钙转染试剂盒，操作按试剂盒说明书进行。同时，将转录质粒pbrt‐ndv与上述辅助质粒按相同的量和方法共转染df1‐t7细胞系。转染3‐5天后，收获培养物上清接种9‐11日龄的spf鸡胚尿囊腔，培养3‐5天，取鸡胚尿囊液测ha效价。收获ha试验结果阳性尿囊液，分装后‐70℃冻存。将拯救的仅p基因改造的毒株命名为rsl‐p株，将拯救的p和f基因共同改造的毒株命名为rsl株。

其中基因vii型新城疫病毒rsl‐p株，其于2017年3月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:v201710；

基因vii型新城疫病毒rsl株，其于2017年3月20日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:v201709；

转染液接胚4天后收获尿囊液，血凝(ha)试验阳性，鸡胚效价在2⁶‐2⁸之间。收获的尿囊液1:1000‐1:10000稀释，继续接胚，0.1ml/枚，4‐5天后收胚；继续传代至第15代。分别取rsl‐p株和rsl株原代、第5代、第10代和第15代病毒尿囊液提取rna，pcr扩增突变的序列位点(p基因和p/f基因)并测序，鉴定结果与预期的结果一致。表明病毒拯救成功，且传代稳定，改造的位点没有再次发生回复突变。

实施例5、新拯救病毒(rsl‐p株和rsl株)的鸡胚平均致死时间(mdt)

用无菌生理盐水将新收获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10^‐7、10^‐8、10^‐93个稀释度，分别接种10日龄鸡胚，每个稀释度接种5个鸡胚，每胚尿囊腔内注射0.1ml，每天在接种的相同时间照蛋1次，记录每一鸡胚的死亡时间，并测定ha活性。连续观察7日，接种鸡胚全部死亡的最高稀释度即为最小致死量。

结果显示，rsl‐p株的mdt值为108h，rsl株的mdt值为128h，具体结果见表5。

表5：rsl‐p株、rsl株鸡胚平均致死时间(mdt)的测定

实施例6、rsl‐p株、rsl株脑内致病指数的测定(icpi)

取1日龄spf雏鸡10只，各脑内注射10^‐1稀释的新鲜含毒尿囊液0.05ml。另取5只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05ml。

接种后，每日在相应接种时间观察，记录雏鸡的情况，分正常、发病和死亡。观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常为0，发病为1，死亡为2)累计总分数。icpi为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的累计总数的平均值。

结果显示，rsl‐p株的icpi值为0.9，rsl株的icpi为0.35，具体结果见表6。

表6：rsl‐p株、rsl株icpi的测定

实施例7、rsl‐p株、rsl株静脉致病指数的测定(ivpi)

取6周龄spf鸡10只，各静脉接种10^‐1稀释的含毒尿囊液0.1ml，另取5只接种生理盐水作对照。每日在接种的相应时间观察，记录接种鸡情况，分正常、发病、麻痹和死亡。

观察10日后，累计正常、发病、麻痹和死亡动物数，根据不同权值(正常为0，发病为1，麻痹为2，死亡为3)累计总分数。ivpi为累计总分除以正常、发病和死亡动物的累计总数。

结果显示，rsl‐p株、rsl株的ivpi值均为0，具体结果见表7。

结合两株拯救毒株mdt、icpi和ivpi值的测定结果分析，rsl‐p株的毒力较野生株sl株的毒力已经大幅下降，说明p基因的两个位点确实影响着sl株的毒力，而通过p基因和f基因联合改造获得的rsl株毒力完全下降，完全符合低毒力毒株的特性，作为疫苗候选株能更加保证疫苗使用的安全性。

表7：rsl‐p株、rsl株ivpi的测定

实施例8、wf株灭活及灭活后的稳定性试验

通过上述一系列验证发现，wf株在生物安全性上有保证，有作为疫苗侯选株的潜力。

将收获的wf株加入终浓度为0.1％的甲醛溶液，37℃灭活24h，置于4℃保存。分别于灭活后0h、24h、48h、7天、15天、1个月测定ha效价，测定灭活病毒的稳定性，结果见表8。另取灭活后的原液，接种10日龄spf鸡胚10枚，0.1ml/枚，37℃培养120h，收胚测效价，检验灭活彻底性。

结果显示，灭活后的病毒较为稳定，放置一段时间后，ha效价没有显著下降。并且灭活较为彻底，灭活后的抗原原液接种鸡胚没有死亡，ha效价全部阴性。

表8：灭活后抗原ha效价

实施例9、wf株灭活疫苗的制备及安全性试验、无菌检验

灭活后的病毒原液，按常规方法制备油佐剂灭活疫苗。每组灭活苗分别用7日龄spf鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时各设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。结果显示，免疫后疫苗吸收效果良好，免疫鸡没有出现任何局部和全身的不良反应，鸡的状态完全正常。

取制备的wf株佐剂疫苗，按2010年版《中国兽药典》附录进行无菌检验，结果符合标准，没有细菌污染。

实施例10、wf株油佐剂灭活疫苗的免疫效果评价

21日龄spf鸡40只，随机分为三组，一组为阴性对照组，一组为wf株疫苗免疫组，另一组为lasota株免疫组。免疫组每只颈部皮下注射疫苗0.2ml，对照组免疫相同剂量的pbs，免疫组与对照组隔离饲养。分别于免后21天、28天采血，分离血清，测定抗体。28天采血后，用临床分离的基因vii型野毒株强毒wh株攻毒，每只鸡肌肉注射10⁶eid50，隔离器饲养，观察14天，每天记录鸡的发病和死亡情况；攻毒后第3天，采集两组免疫组鸡的喉拭子和泄殖腔拭子接胚，检测排毒情况。

结果显示，免疫组免疫21天后均可产生较高水平抗体，28天抗体水平更高，结果见表9所示。攻毒后，免疫组没有出现任何死亡，而5天后阴性对照组鸡全部死亡。排毒情况显示，免疫wf株疫苗的动物没有出现排毒，而lasota株仍有排毒现象，见表10和表11所示。

表9：免疫后抗体效价测定

表10：免疫效力实验结果

表11:攻毒后第3天病毒分离结果

综上所述，本发明通过自然筛选获得的疫苗侯选株wf株，通过做成疫苗免疫动物后发现，能诱导产生较高的中和抗体，能抵抗强毒力基因vii型新城疫病毒的侵害，有广阔的应用前景。

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<110>山东信得科技股份有限公司

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