微孔板法测定P型红辉沸石分子筛抗菌剂抗菌性能的方法与流程

本发明属于复合生物技术领域，特别涉及一种微孔板法测定p型红辉沸石分子筛抗菌剂抗菌性能的方法。

背景技术：

由于抗生素的大量使用，细菌的耐药性逐渐增强，尤其是超级细菌的出现，传统抗生素的利用受到极大限制，生产新型抗菌药物成为抗菌问题的关键。

广西红辉沸石矿属于低温热液型，含量丰富，并且具有较高的可塑性，成为抗菌物质载体的首选。p型红辉沸石分子筛抗菌剂的合成，将p型红辉沸石分子筛，壳聚糖和二甲酸钾按3:1:2的比例称量，取称量的分子筛加水搅拌，用低浓度的盐酸调节ph至6，同时将壳聚糖和二甲酸钾搅拌呈凝胶状，最后将混合液倒入分子筛溶液中搅拌，反应时间为2h，温度控制在40℃。p型红辉沸石分子筛抗菌剂具有高效、广谱、持久、可加工性好、安全稳定的特点。

分子筛，又名沸石，有很强的离子置换能力，是一类硅酸盐或硅铝酸盐晶体材料。它既天然存在也可以人工合成，具有规则微孔和四面体骨架单元。其氧原子相互联接，构成规则孔道的三维结构。分子筛的硅铝比决定了其化学性质，热稳定性和局部的极性。此外，它的尺寸和形状选择性以及离子交换性等由自身的孔道形状，大小以及硅铝比决定。研究表明，分子筛具有生物活性，生物稳定性以及良好的生物相容性，引起国内外研究人员的广泛关注和重视。不仅如此，沸石可以抗细菌、抗病毒以及抗真菌。

壳聚糖，是一种天然氨基多糖，由甲壳素经脱乙酰化剂制得。其中甲壳素经脱乙酰化剂广泛存在于节肢动物外壳和真菌类细胞壁中。壳聚糖是无毒的，并且它的生物降解，生物相容及生物活性功能，成膜特性和抗菌防腐能力都存在巨大的优势。

二甲酸钾，又称双甲酸钾，是一种有机酸盐。它为白色或微黄色，易溶于水，酸性条件下较稳定，在中性或偏碱性的环境下易分解为甲酸与甲酸钾。其无抗药性、无残留、无毒害，可作为抗生素替代品。并且可以降低消化道ph值，增强胃蛋白酶活性，促进蛋白质消化吸收，抑制有害微生物繁殖，促进有益菌增殖。

杨晓楠，王猛等人利用酶标仪建立番茄灰霉病菌(botrytiscinerea)对杀菌剂敏感性的快速、高效测定方法。以od增加值作为评价指标，确立微孔板法检测灰霉病菌敏感性的测试条件,并对啶酰菌胺、嘧菌酯、乙霉威、甲基硫菌灵、异菌脲、苯醚甲环唑6种常用杀菌剂对灰霉病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制效果进行评价，将结果与孢子萌发法和菌丝生长速率法所得结论进行比对。

刘峰骆，健美等人建立了一种新型的微孔板生物检测用于快速测定大量纳他霉素样品含量。结果表明：微孔板中纳他霉素浓度在0.95~2.14mg/l与抑菌率呈较显著的线性关系，微孔板生物检测法与hplc法测定的结果无显著差异，该方法具有处理量大、操作简单、平行性好等特点，可用于发酵过程中纳他霉素产量的定量和突变菌的高通量快速筛选工作。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种微孔板法测定p型红辉沸石分子筛抗菌剂抗菌性能的方法。

具体步骤为：

(1)称取p型红辉沸石分子筛抗菌剂敞开置于超净工作台紫外灭菌，然后加入到无菌液体培养基中，分别配制成浓度为6mg/ml、12mg/ml、24mg/ml、48mg/ml、96mg/ml的梯度浓度抗菌剂。

(2)在96微孔板中，取1个微孔作为空白对照孔，加入200µl无菌液体培养基；取1个微孔作为菌液对照孔，加入200µl待测菌培养液；其余每排微孔作为梯度浓度抗菌剂测定孔，向其中加入200μl步骤(1)配制的梯度浓度抗菌剂，每个浓度加3个微孔，然后再加入10µl待测菌培养液，用封口膜封口，在37℃下以220r/min的转速振荡培养18h后观察各个微孔的浊度。

(3)分析步骤(2)的观察结果，澄清的微孔表示无细菌生长，浑浊的微孔则表示有细菌生长，以无细菌生长的最小浓度作为p型红辉沸石分子筛抗菌剂的最小抑菌浓度；依次取无细菌生长的各微孔培养物100µl，涂布于固体培养基上，37℃下培养18h，平板上菌落数小于5个的最大浓度即为p型红辉沸石分子筛抗菌剂的最小杀菌浓度。

(4)分别取50ml步骤(1)配制的梯度浓度抗菌剂，每个浓度取3份，并加入100μl已活化的待测菌，同时增加一组空白，然后均置于37℃下以220r/min的转速振荡培养48h，期间每2h取菌液200μl，装入96微孔板中，利用酶标仪在630nm处测定od值，根据测得数据绘制抗菌剂对待测菌的生长曲线图，即实现微孔板法测定p型红辉沸石分子筛抗菌剂抗菌性能。

所述待测菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌中的一种。

本发明方法操作简单，对于红辉沸石抗菌的抗菌率的分析，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的生长曲线均有影响，浓度越大抑菌效果越明显；微孔梯度法和传统试管梯度法的结论是一致的，说明微孔板法测定红辉沸石分子筛抗菌剂抗菌性能的方法是可靠的，且微量、快速。

附图说明

图1为本发明实施例中p型红辉沸石分子筛抗菌剂对大肠杆菌生长曲线的影响。

图2为本发明实施例中p型红辉沸石分子筛抗菌剂对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。

图3为本发明实施例中p型红辉沸石分子筛抗菌剂对枯草芽孢杆菌生长曲线的影响。

具体实施例

对照例：

使用传统试管梯度法测定p型红辉沸石分子筛抗菌剂的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。

称取p型红辉沸石分子筛抗菌剂0.3g，0.6g，1.2g，2.4g，4.8g各9份，分别加入已灭菌的50ml普通培养基为待测液，将已活化的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌100µl加入待测液中，相应浓度的p型红辉沸石分子筛抗菌剂作样品对照。将试管放入振荡培养箱，转速调为220r/min，37℃恒温培养。18h后观察。培养液澄清，摇匀后仍澄清的试管表示无细菌生长，培养液浑浊则表示有细菌生长。以无细菌生长的最小浓度作为p型红辉沸石分子筛抗菌剂的最小抑菌浓度值。依次取未见细菌生长的各管培养物100µl，涂布于固体培养基上，37℃培养18h。平板上菌落数小于5个的最大浓度即为p型红辉沸石分子筛抗菌剂的最小杀菌浓度值。

实施例：

在96微孔板中，取3个微孔作为空白对照孔，每个微孔内分别装有200µl无菌液体培养基；取9个微孔作为菌液对照孔，分别为枯草芽孢杆菌培养液，金黄色葡萄球菌培养液和大肠杆菌培养液，每孔均为200µl。其余每排微孔作为不同浓度的样品测定孔，每个浓度3个微孔。称取p型红辉沸石分子筛抗菌剂配制成梯度浓度为96，48，24，12，6mg/ml，取200μl加入微孔板中，再依次加入10µl细菌培养液，封口膜封口。37℃转速调为220r/min振荡培养18h后观察，比较各个微孔之间的浊度。培养液澄清，摇匀后仍澄清的微孔表示无细菌生长，培养液浑浊则表示有细菌生长。以无细菌生长的最小浓度作为p型红辉沸石分子筛抗菌剂的最小抑菌浓度值。依次取未见细菌生长的各孔培养物100µl，涂布于固体培养基上，37℃培养18h。平板上菌落数小于5个的最大浓度即为p型红辉沸石分子筛抗菌剂的最小杀菌浓度值。

称取p型红辉沸石分子筛抗菌剂为0.3g，0.6g，1.2g，2.4g，4.8g各9份，分别加入已灭菌的50ml培养基为待测液，将已活化的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌100µl加入待测液中，同时做一组空白。于37℃转速调为220r/min振荡培养48h，每2h取菌液200μl，装入96微孔板中，利用酶标仪在630nm处测定od值，并根据测得数据绘制生长曲线图，即实现微孔板法测定p型红辉沸石分子筛抗菌剂抗菌性能。

实验结果表明，p型红辉沸石分子筛抗菌剂对三种菌的最小抑菌浓度均在12~24mg/ml之间，最小杀菌浓度均在48~96mg/ml之间。