利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素AD的方法及其制备方法与流程

本项发明涉及的是一种生物制剂的制备方法，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素ad的方法及其制备方法。

背景技术：

广谱抗生素的大量使用不仅导致了耐药菌在世界范围内频繁出现，而且其在清除病原菌的同时也杀灭了正常细菌，对机体微生态平衡造成了严重破坏，在临床上经常出现继发感染等负面后果。抗菌肽以其卓越的抗菌活性及独特的作用机制而倍受青睐。抗菌肽(antimicrobialpeptide，amp)，又称为宿主防御肽(hostdefensepeptide，hdp)，是机体先天免疫系统的重要组成部分，是保护宿主抵御外源病菌侵入的屏障。抗菌肽来源广泛，具有调节免疫，广谱杀灭细菌、真菌、病毒、寄生虫、癌细胞等多方面的生物学功能。此外，抗菌肽特殊的作用机制成为新一代抗菌药物的潜质。天蚕素ad是人工设计的由天蚕素a的n端1～11片段和天蚕素d的c端12～37片段组成的杂合肽，据测定，化学合成的天蚕素ad，其杀菌活性和抗茵谱都明显高于天然抗茵肽(杀菌活性是抗茵肽d的5～55倍，对枯草杆菌的活性是抗菌肽a的6倍)目前已有多种方法被用于天蚕抗菌肽ad的基因表达，但都存在成本较高、分离纯化困难的问题。

获取抗菌肽主要通过以下途径，一是从生物体内直接提取、二是应用化学合成技术生产，三是通过基因工程技术进行制备。但由于天然抗菌肽含量少，直接提取不仅难度大还受到技术的限制；化学合成成本高，很难形成规模化生产。随着基因工程技术的成熟，通过重组技术表达外源蛋白成为可能，因此借助基因工程技术手段，构建生物反应器实现抗菌肽的规模化廉价生产，最终实现抗菌肽的广泛应用，对于促进绿色农业与畜牧业发展有重要意义。本项发明选用枯草芽孢杆菌做为表达宿主菌，表达系统中使用高效启动子pglv，利用廉价无污染且容易获得的麦芽糖作为诱导剂成功的表达了抗菌肽cad。为今后开发全新高效抗菌肽类饲料添加剂提供理论基础与实验依据。

技术实现要素：

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素ad的方法及其制备方法，利用基因工程技术在枯草芽孢杆菌中表达了天蚕素ad。

本发明所采用的技术如下：一种利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素ad的方法，如下：

(1)、基因合成：人工设计编码目的基因片段，在天蚕素ad基因上游融合信号肽spsacb基因、六个组氨酸基因、sumo标签，并在5’端加上ecori酶切位点，在3’端加上终止密码子和bamhi酶切位点，整条融合基因spsacb-6×his-sumo-cecropinad，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示；

(2)、表达质粒的构建及转化：表达载体以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pgj148作为骨架，启动子为麦芽糖启动子pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢杆菌wb800n作为表达宿主菌，利用化学转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌wb800n中，表达产物经过纯化蛋白酶切后进行tricine-sds-page定性和质谱检测分析，实现融合蛋白的表达。

本发明还具有如下技术特征：一种利用枯草芽孢杆菌制备天蚕素ad的方法，如下：

(1)、人工设计编码目的基因片段，在天蚕素ad基因上游融合信号肽spsacb基因、六个组氨酸基因、sumo标签，并在5’端加上ecori酶切位点，在3’端加上终止密码子和bamhi酶切位点，整条融合基因spsacb-6×his-sumo-cecropinad，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示；

(2)、表达载体以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pgj148作为骨架，启动子为麦芽糖启动子pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢杆菌wb800n作为表达宿主菌，利用化学转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌wb800n中，表达产物经过纯化蛋白酶切后进行tricine-sds-page定性和质谱检测分析，实现融合蛋白的表达；

(3)、诱导发酵

分别挑取阳性重组子单菌落分别接种于含氯霉素、新霉素各10μg/ml的10mllb培养基中，37℃，220rpm条件下过夜振荡培养，按体积比为1％的接种量转接到50ml新鲜lb培养基中，37℃，220rpm条件下振荡培养，发酵4h后加入最终质量浓度为6％的麦芽糖后进行诱导表达，48h后收集菌液上清；

(4)、融合蛋白的纯化

收集菌液上清后混合5×binddingbuffer，binddingbuffer含有20mmtris、500mmnacl、和20mm咪唑，过ni-nta柱，用含20mm、50mm、100mm、200mm、300mm、500mm咪唑的washingbuffer，进行梯度洗脱；

(5)、纯化

将纯化后的融合蛋白在sumo酶切buffer中透析后，进行4℃过夜酶切，将酶切体系过ni-nta，重组蛋白在穿流液中获得，用去离子水透析，冻干后即获得重组蛋白纯品。

本发明的有益效果及优点如下：

1、本发明将sumo分子伴侣与抗菌肽ad融合，可促进抗菌肽ad正确折叠，融合状态下抗菌肽没有活性，对宿主菌不会产生杀灭作用，单独表达小分子蛋白时得率低，不易于表达，与sumo融合后可提高目的蛋白的得率，还融合6*his标签，便于后期的分离纯化，利用镍柱与his形成螯合物，使得目的蛋白易于与其他杂蛋白分离。后期纯化的融合蛋白在sumo蛋白酶特异性识别后可准确切割下标签，释放具有活性的抗菌肽ad。

2、本发明选择的强分泌型信号肽scab，有效增强抗菌肽ad的可溶性，并分泌到胞外培养基中，利于分离纯化。

3、本发明选用价格低廉且安全高效的麦芽糖诱导型启动子pglv，具有巨大的实际应用价值。

4、宿主枯草芽孢杆菌为蛋白酶缺陷菌株，敲除npre、nprb、apre、mpr、bpf、vpr、wpra、ner八种蛋白酶基因，酶活力比野生菌株大大降低，分泌的重组蛋白不易被自身蛋白酶降解，同时容易进行感受态转化，具有新霉素抗性可以作为遗传标记，便于筛选，简化筛选过程。

附图说明

图1为重组表达载体构建测序结果图；

图2为重组表达载体酶切鉴定结果图；

图3为融合蛋白梯度洗脱结果图。

具体实施方式

下面举例对本发明做进一步说明：

实施例1

一种利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素ad的方法，如下：

(1)、基因合成：人工设计编码目的基因片段，在天蚕素ad基因上游融合信号肽spsacb基因、六个组氨酸基因、sumo标签，并在5’端加上ecori酶切位点，在3’端加上终止密码子和bamhi酶切位点，整条融合基因spsacb-6×his-sumo-cecropinad，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示；

(2)、表达质粒的构建及转化：表达载体以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pgj148作为骨架，启动子为麦芽糖启动子pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢杆菌wb800n作为表达宿主菌，利用化学转化方法将重组载体直接转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌wb800n中，表达产物经过纯化蛋白酶切后进行tricine-sds-page定性和质谱检测分析，实现融合蛋白的表达。

本实施例将带有信号肽sacb、蛋白标签6×his-sumo的目的基因连接到大肠-枯草穿梭表达载体pgj148上，利用化学方法将质粒转入到枯草芽孢杆菌wb800n感受态细胞中，阳性转化子经双酶切及测序验证，验证正确后在诱导剂麦芽糖的作用下，实现融合蛋白的表达。

实施例2

一种利用枯草芽孢杆菌制备天蚕素ad的方法，如下：

1、基因合成

天蚕素ad的氨基酸序列为：kwklfkkiekvgqrvrdavisagpavatvaqatalak，人工设计编码基因片段，并在5’端加上ecori酶切位点、信号肽spsacb、6×his标签、sumo，在3’端加上终止密码子和bamhi酶切位点，整条融合基因spsacb-6×his-sumo-cecropinad，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示，基因合成由北京六合华大基因科技有限公司完成。

2、表达质粒的构建及转化

1)将人工合成的编码基因克隆到枯草芽孢杆菌表达载体上，构建重组表达载体，构建的重组表达载体通过单双酶切和测序进行阳性筛选；

2)将目的基因合表达载体的链接体系利用化学方法转化到表达宿主菌枯草芽孢杆菌wb800n中，筛选阳性克隆并进行表达。产物纯化后经tricine-sds-page定性、考马斯亮蓝定量分析以及质谱定性分析。

3、诱导发酵

分别挑取阳性重组子单菌落分别接种于含氯霉素、新霉素各10μg/ml的10mllb培养基中，37℃，225rpm条件下过夜振荡培养。按1％的接种量转接到50ml新鲜lb培养基中，37℃，225rpm条件下振荡培养。发酵4h后加入终质量浓度为6％的麦芽糖后进行诱导表达，48h后收集菌液上清。

4、融合蛋白的纯化

收集菌液上清后混合5×binddingbuffer，含有20mmtris、500mmnacl、20mm咪唑，过ni-nta柱，用含20mm、50mm、100mm、200mm、300mm、500mm咪唑的washingbuffer，进行梯度洗脱。

5、纯化

将纯化后的融合蛋白在sumo酶切buffer中透析后，进行4℃过夜酶切，将酶切体系过ni-nta，重组蛋白在穿流液中获得，用去离子水透析，冻干后即获得重组蛋白纯品。

本实施例以枯草芽孢杆菌wb800n为宿主菌株，大肠-枯草穿梭载体为表达载体，设计合成融合蛋白编码基因(spsacb)sumo-cad，成功构建重组表达载体pgj148-(psacb)sumo-cad。应用化学转化方式转入宿主菌感受态细胞中，利用麦芽糖诱导发酵，实现外源蛋白成功表达，通过ni-nta柱和蛋白质纯化分析仪纯化后获得了纯度较高的融合蛋白，利用sumo酶切后获得重组抗菌肽，之后对发酵条件进行优化，确定最佳初始发酵培养基及最佳发酵条件，为进一步扩大发酵提供理论依据。

＜110＞东北农业大学

＜120＞利用枯草芽孢杆菌表达天蚕素ad的方法及其制备方法

＜160＞2

＜210＞1

＜211＞534

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞1

gaattcatgaacatcaagaaatttgctaaacaggcaacggtcctgacgttcacgaccgca60

ctcttggcaggaggagcaactcaagctttcgctcaccatcatcatcatcacatgagtgat120

tctgaagttaatcaagaggcgaaaccagaagttaaacctgaggtgaaacctgaaacacat180

atcaacttgaaagtaagcgacggttcgtcagagatcttctttaagataaagaaaaccact240

ccgctgcgaaggctgatggaggcgtttgcgaaacgacaaggcaaagaaatggactccctt300

aggtttctttacgatggtatccgtattcaggccgatcaaacaccggaagacttagatatg360

gaagataatgatattattgaagcccaccgggaacagattggcggcgccacatataagtgg420

aagctgttcaagaagatcgaaaaagtcggccagcgcgttagagacgcagttatttcagca480

ggaccggcagttgcaacagttgcacaagcaacagcactggcaaaataaggatcc534

＜210＞2

＜211＞173

＜212＞prt

＜213＞人工序列

＜400＞2

mnikkfakqatvltfttallaggatqafahhhhhhmsdsevnqeakpevkpevkpethin60

lkvsdgsseiffkikkttplrrlmeafakrqgkemdslrflydgiriqadqtpedldmed120

ndiieahreqiggatykwklfkkiekvgqrvrdavisagpavatvaqatalak173