牛膝糖聚合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于医药及保健品技术领域，具体涉及一种牛膝糖聚合物及其制备方法和应用。

背景技术：

骨质疏松症(osteoporosis,op)是一种以骨量减少，骨微结构受到破坏，同时骨强度降低，从而引起骨的脆性增加和容易于发生骨折为特征的一种疾病。目前防治骨质疏松症的药物主要是骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和矿化药物，这些药物均属替代治疗，在长期使用过程中，存在毒副作用大，靶向性低，依从性差，费用高等缺点。因此，有必要找寻到一种高效、低毒的药物来治疗骨质疏松症。

牛膝(achyranthesbidentatablume)为苋科植物牛膝的干燥根，被称为“四大怀药”之一，具有补肝肾、强筋骨的功效；其主要用于筋骨无力、腰膝酸痛、肝阳眩晕等症。另外，牛膝还作为活血化瘀的传统中药。现代药理研究表明，其药理作用较为广泛，具有抗骨质疏松、抗炎镇痛、抗肿瘤、促进蛋白质的合成和促进胃肠的兴奋性等功效。中医上有“肾藏精，主骨”的理论，所以一般运用补肾法作为治疗骨质疏松症，已经证实疗效显著。作为滋补肾精类中药，怀牛膝在治疗骨质疏松症方面的运用已经得到广泛认可。

高昌琨在现代中药研究与实践发表的论文《怀牛膝对维甲酸所致大鼠骨质疏松防治作用的实验研究》中提到“怀牛膝水煎液能够在一定程度提高大鼠的活动能力，使得骨中有机质的含量增加，继而提高骨密度”。同时，牛膝糖聚合物作为牛膝的主要活性成分之一，其结构和活性的报道较少，因此，有必要提供一种提取纯化、结构鉴定的方法。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛膝糖聚合物及其制备方法和应用。本发明制备方法简单，反应条件温和，可大规模生产；且本发明对得到的高纯度牛膝糖聚合物化学结构进行了鉴定，明确了其成分，为探究其药理活性机制提供结构依据。同时，本发明得到的牛膝糖聚合物纯品为牛膝糖聚合物药物、质量控制及深入研究其构效关系和作用机制奠定基础。

本发明提供了一种牛膝糖聚合物，包括牛膝糖聚合物abp3-2，牛膝糖聚合物abw1-1，牛膝糖聚合物abp1-2，牛膝糖聚合物abp4-3。本发明人通过对牛膝糖聚合物粗品提纯分离得到牛膝糖聚合物abp3-2，abw1-1，abp1-2，abp4-3，且经结构分析得到其分子量范围为1000-100000da。

进一步地，所述牛膝糖聚合物abp3-2的结构为：

其中n为1～6或8～30。

进一步地，所述牛膝糖聚合物abw1-1的结构为：

其中x为2～30，y为2～30。

进一步地，所述牛膝糖聚合物abp1-2的结构为：

其中n为1～6或8～30，m为1～11或13～30。

进一步地，所述牛膝糖聚合物abp4-3的结构为：

其中n为1～30，m为1～30，x为1～30，y为1～30。

同时，本发明也提供了一种牛膝糖聚合物的制备方法，包括以下步骤：

s1剪切：将牛膝干燥根切成小段，用水清洗干净、晾干，得牛膝段；

s2水提：将步骤s1所得牛膝段加入水中，加热提取，过滤，得提取液和药渣；

s3分级醇沉：

将步骤s2所得提取液减压浓缩，得浓缩液1；向浓缩液1中加入乙醇，至乙醇体积浓度为a％，静置，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab1和上清液1；

将上清液1减压浓缩，得浓缩液2；向浓缩液2中加入乙醇，至乙醇体积浓度为b％，静置，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab2和上清液2；

将上清液2减压浓缩，得浓缩液3；向浓缩液3中加入乙醇，至乙醇体积浓度为c％，静置，收集沉淀，得粗糖聚合物ab3；

其中10≤a＜b＜c＜100；

s4碱提：

将步骤s2所得药渣浸泡于0.1～1m的naoh溶液中，静置1～10h，收集上清液，得上清液3；

向上清液3中加入0.1～1m的hcl至溶液ph为5～9，离心，收集上清液，减压浓缩，得浓缩液4；向浓缩液4中加入乙醇，至乙醇体积浓度为50～90％，静置，收集沉淀，得碱提粗糖聚合物ab4；

s5纯化：

一次纯化：将步骤s3、s4所得粗糖聚合物ab1、ab2、ab3、ab4进行除蛋白，透析，冻干，得牛膝糖聚合物；

二次纯化：

将一次纯化后的糖聚合物ab1、ab3、ab4进行离子交换柱层析，用0～2m的nacl进行梯度洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分，浓缩、冷冻干燥；再分别用水进行溶解，离心，取上清液；

将上清液再进行分子筛凝胶柱层析，用水进行洗脱，利用苯酚-硫酸法检测洗脱曲线，根据洗脱曲线收集糖部分，浓缩、冷冻干燥，得abw1-1、abp1-2、abp3-2、abp4-3。

本发明人通过研究发现牛膝段的优选长度为1～3cm；同时，本发明采用水提分级醇沉法和碱提醇沉法的结合，乙醇浓度由低到高进行分级醇沉，对牛膝糖聚合物进行初步分离，且高浓度乙醇能将极性大、水溶性好的糖聚合物与极性小、水溶性差的糖聚合物分离，解决了传统水煮法提取糖聚合物导致其后期分离繁杂、困难的问题。

进一步地，所述步骤s2中水的添加量为所述牛膝段重量的5～15倍，加热温度为60～100℃，提取时间1～10h。

进一步地，所述步骤s3、s4中减压浓缩温度为40～70℃，静置的时间为10～28h，naoh溶液用量为药渣重量的5～20倍。

另外，本发明还提供了一种牛膝糖聚合物的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)取牛膝糖聚合物样品，完全酸水解，水解产物离子色谱/液相色谱检测；

(2)取牛膝糖聚合物样品，干燥，压片，红外光谱检测；

(3)取牛膝糖聚合物样品，甲基化，水解、还原，乙酰化，进行gc-ms检测；

(4)取牛膝糖聚合物样品溶于d2o，进行核磁共振分析。

本发明人为了进一步开发牛膝这一宝贵资源，发掘新药源，通过大量实验研究得到本发明：以牛膝干燥根为原料，采用水提醇沉法和碱提醇沉法得到粗糖聚合物，对提取的粗糖聚合物进行脱蛋白，然后利用离子交换层析和凝胶分子筛柱层析方法纯化牛膝粗糖聚合物，首次制备出四种牛膝糖聚合物纯品，对四种组分糖聚合物纯品的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴定，成功得出了四个组分的结构信息，其中牛膝糖聚合物abp3-2由葡萄糖和果糖组成的果聚糖，主链由→2)-α-d-fruf-(6→组成，支链由→2)-β-d-fruf-(1→组成，末端糖残基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf组成；牛膝糖聚合物abw1-1由葡萄糖和果糖组成的果聚糖，主链由→2)-α-d-fruf-(1→组成，支链由→2)-β-d-fruf-(6→组成，末端糖残基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf组成；牛膝糖聚合物abp1-2由葡萄糖和果糖组成的果聚糖，主链由→2)-α-d-fruf-(1→组成，支链由→2)-β-d-fruf-(6→组成，末端糖残基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf组成；牛膝糖聚合物abp4-3由阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和半乳糖醛酸组成的杂多糖，主链由→4)-α-d-galpa-(1→和→2,4)-α-d-galpa-(1→组成，支链包括→5)-α-l-araf-(1→、→3)-α-l-araf-(1→、→2,3,5)-α-l-araf-(1→、→6)-β-d-galp-(1→、→3,6)-β-d-galp-(1→、α-l-araf-(1→、α-l-rhap-(1→和β-d-galp-(1→。

本发明还涉及了牛膝糖聚合物在制备治疗骨质疏松药物或保健品中的应用。并通过实验研究对其抗骨质疏松活性进行评价。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1.本发明采用水提醇沉法和碱提醇沉法的结合，对牛膝糖聚合物进行初步分离，效果显著，且本制备方法简单，反应条件温和，可大规模生产；

2.本发明通过柱层析法对牛膝粗糖聚合物进行二次分离纯化，效果显著，首次制备出四种牛膝糖聚合物纯品；

3.本发明对纯化得到的四种糖聚合物纯品的结构进行了鉴定，明确了各糖聚合物组分的理化性质及结构，为探究其药理活性机制提供结构依据；

4.本发明得到的牛膝糖聚合物纯品，组分保存完好，结构明确，质量可控，在斑马鱼骨质疏松模型中显示具有抗骨质疏松活性，为牛膝糖聚合物在医药、保健品等领域的应用提供依据；

5.同时，本发明为牛膝糖聚合物药物、质量控制及深入研究其构效关系和作用机制奠定基础。

附图说明

图1为abp3-2的离子色谱图谱图；

图2为abp3-2的红外图谱；

图3为abp3-2的¹hnmr图谱；

图4为abp3-2的¹³cnmr图谱；

图5为abp3-2的hsqc图谱；

图6为abp3-2的hmbc图谱；

图7为abw1-1的hplc图谱；

图8为abw1-1的红外图谱；

图9为abw1-1的¹hnmr图谱；

图10为abw1-1的¹³cnmr图谱；

图11为abw1-1的hsqc图谱；

图12为abw1-1的hmbc图谱；

图13为abp1-2的离子色谱图谱图谱；

图14为abp1-2的红外图谱；

图15为abp1-2的¹hnmr图谱；

图16为abp1-2的¹³cnmr图谱；

图17为abp1-2的hsqc图谱；

图18为abp1-2的hmbc图谱；

图19为abp4-3的hplc图谱；

图20为abp4-3的红外图谱；

图21为abp4-3的¹hnmr图谱；

图22为abp4-3的¹³cnmr图谱；

图23为abp4-3的hsqc图谱；

图24为abp4-3的hmbc图谱；

图25为斑马鱼经abw1-1处理后头部骨骼钙黄绿素染色的图像；

图26为斑马鱼经abw1-1处理后头部骨骼相对荧光强度的定量分析；

图27为斑马鱼经abp4-3处理后头部骨骼钙黄绿素染色的图像；

图28为斑马鱼经abp4-3处理后头部骨骼相对荧光强度的定量分析。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。

实施例1牛膝糖聚合物的制备方法

所述牛膝糖聚合物的制备方法包括以下步骤：

s1剪切：将10kg的牛膝干燥根用剪刀剪至1～3cm，用冷水快速清洗，晾干，得牛膝段；

s2水提：向步骤s1所得牛膝段中加入其重量10倍的水，加热至80℃提取，提取2h，收集提取液，药渣晾干，得提取液和药渣；

s3分级醇沉：

将步骤s2所得提取液于60℃减压浓缩后，加入乙醇至乙醇体积浓度为50％，室温静置24h后，离心，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab1和上清液1；

上清液1于60℃减压浓缩后，加入乙醇至乙醇体积浓度为70％，室温静置24h后，离心，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab2和上清液2；

上清液2于60℃减压浓缩后，加入乙醇至乙醇体积浓度为90％，室温静置24h后，离心，收集沉淀和上清液，得粗糖聚合物ab3；

s4碱提：

向步骤s2所得药渣中加入其重量15倍的0.3m的naoh溶液，室温放置2h，收集上清液，得上清液3；

向上清液3中加入0.1～1m的hcl至溶液ph为6～8，离心(5000r/min，10min)，收集上清液，60℃减压浓缩，然后加入乙醇至乙醇体积浓度为75％，静置24h后离心，收集沉淀，得碱提粗糖聚合物ab4；

s5纯化：利用sevag法分别将步骤s3、s4所得ab1、ab2、ab3、ab4粗糖聚合物进行除蛋白，除蛋白后粗糖聚合物用透析袋(截留分子量为1000da)进行透析、冻干，得牛膝糖聚合物(牛膝糖聚合物ab1、ab2、ab3、ab4)。

实施例2牛膝糖聚合物abp3-2

所述牛膝糖聚合物abp3-2是由实施例1所得牛膝糖聚合物ab3二次纯化所得，具体方法如下：

1)离子交换柱层析：取100mg实施例1所得牛膝糖聚合物ab3，溶于5ml的去离子水中，上样于deae-cellulose52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现2个峰，其中峰一为水(0m的nacl)洗脱部分，峰二为0.1m的nacl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液浓缩、冷冻干燥后，得到两种糖聚合物(峰一糖聚合物、峰二糖聚合物)；

2)分子筛凝胶层析：将上述冻干后的峰二糖聚合物样品，用水进行溶解，离心，取上清液，上sephacryls-100hr柱，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，冷冻干燥，得牛膝糖聚合物abp3-2。

实施例3牛膝糖聚合物abw1-1

所述牛膝糖聚合物abw1-1是由实施例1所得牛膝糖聚合物ab1二次纯化所得，具体方法如下：

离子交换柱层析：取100mg实施例1所得牛膝糖聚合物ab1，溶于5ml的去离子水中，上样于deae-cellulose52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现2个峰，其中峰一为水(0m的nacl)洗脱部分，峰二为0.1m的nacl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，收集峰一洗脱液，浓缩、冷冻干燥，得牛膝糖聚合物abw1-1。

实施例4牛膝糖聚合物abp1-2

所述牛膝糖聚合物abp1-2是由实施例1所得牛膝糖聚合物ab1二次纯化所得，具体方法如下：

离子交换柱层析：取100mg实施例1所得牛膝糖聚合物ab1，溶于5ml的去离子水中，上样于deae-cellulose52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现2个峰，其中峰一为水(0m的nacl)洗脱部分，峰二为0.1m的nacl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，收集峰二洗脱液，浓缩、冷冻干燥，得牛膝糖聚合物abp1-2。

实施例5牛膝糖糖聚合物abp4-3

所述牛膝糖聚合物abp4-3是由实施例1所得牛膝糖聚合物ab4二次纯化所得，具体方法如下：

1)离子交换柱层析：取100mg实施例1所得牛膝糖聚合物ab4，溶于5ml的去离子水中，上样于deae-cellulose52柱，在不同盐浓度的洗脱液条件下出现4个峰，其中峰一为0.05m的nacl洗脱部分，峰二为0.1m的nacl洗脱部分，峰三为0.15m的nacl洗脱部分，峰四为0.2m的nacl洗脱部分(洗脱过程中使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收集糖部分)，分别将所得洗脱液浓缩、冷冻干燥后，得到四种糖聚合物；

6)分子筛凝胶层析：将上述冻干后的峰三糖聚合物样品，用水进行溶解，离心，取上清液，上sephacryls-100hr柱，用水进行洗脱，使用苯酚-硫酸法跟踪洗脱曲线，出现一个单一对称峰，收集主峰，浓缩，冷冻干燥，得牛膝糖聚合物abp4-3。

试验例一、牛膝糖聚合物abw1-1、abp1-2、abp3-2和abp4-3的结构分析

(一)试验材料：牛膝糖聚合物abw1-1、abp1-2、abp3-2和abp4-3。

(二)试验方法：

1.单糖组成分析

(1)pmp柱前衍生化hplc分析

样品处理：

精确称取4.0mg试验材料于具塞试管中，加入2m三氟乙酸(tfa)2.0ml，充n2封管，置于油浴锅中在120℃油浴水解6h。冷却至室温，重复加甲醇旋干，去除tfa，用去离子水溶解至1ml，离心，各吸取100μl样品溶液，加入100μl0.3m的naoh溶液，再加入100μl0.5mpmp甲醇溶液，混匀，70℃水浴锅上反应30min，冷却，加入105μl0.3m的hcl溶液中和，加去离子水至1ml，再加入等体积的氯仿溶液，剧烈震摇，离心，去氯仿相，如此反复2次萃取，取水相用0.45μm滤膜过滤后供hplc进样分析。

色谱条件：

色谱柱：agilentzorbaxeclipsexdb-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：0.1m磷酸盐(ph＝6.9)缓冲液-乙腈(v/v为83：17)；检测波长：250nm；流速：1ml/min；进样体积：20μl。

(2)高效离子色谱分析

样品处理：

精密称取4.0mg试验材料于具塞试管中加入2mtfa2ml，在120℃中恒温油浴6h，冷却至室温，重复加甲醇旋干以去除tfa，用蒸馏水溶解至1ml，0.45μm滤膜过滤，供离子色谱分析。

色谱条件：

色谱柱：dionexcarbopacpa10，规格250×4mm；流动相：水-200mmnaoh溶液(v/v为92:8)，流速为1.0ml/min；进样体积为20μl，柱温为30℃。

2.红外光谱检测

将干燥的试验材料2.0mg与kbr研磨后，压片，用perkineimerft/ir-100在4000-450cm^-1范围内进行扫描。

3.甲基化/gc-ms分析

称取干燥的试验材料8.0mg于反应瓶中，加入无水dmso8ml，再加入干燥的氢氧化钠800mg，磁力搅拌10min，冰浴条件下，通入n2避光加入碘甲烷4.5ml，室温搅拌反应8h，然后加入2ml的蒸馏水分解残留的碘甲烷，用蒸馏水透析24h，减压浓缩，样品烘干后用1ml氯仿溶解。

甲基化完全后置于具塞试管中用2mol/l的tfa在120℃恒温油浴水解6h，减压蒸发至干，再重复多次加入甲醇旋干至ph为中性，然后用20mg的nabh4在40℃下反应30min还原水解产物。再使用100μl的冰醋酸终止反应，样品在低压下旋干，然后加入2ml的乙酰酐和吡啶用来乙酰化。保持95℃磁力搅拌反应2h。然后反复加甲苯3次，旋干，用1ml氯仿溶解，再用等体积的蒸馏水洗涤4次，除去水层，最后用无水硫酸钠干燥氯仿层，再过滤除去硫酸钠固体，减压浓缩蒸干，供gc-ms分析。

4.核磁共振分析

取各牛膝糖聚合物样品30mg溶于0.6mld2o中，反复多次冻干后，置于核磁管中，用500mhz核磁共振仪brukerav-500记录其¹hnmr，¹³cnmr，hsqc，hmbc等图谱。

(三)试验结果：

1.牛膝糖聚合物abp3-2结构分析

(1)单糖组成分析

如图1所示，由完全酸水解产物hpaec-pad图谱可知，abp3-2是由葡萄糖和果糖组成。图a为各单糖标准品的hpaec-pad图谱，1：鼠李糖，2：阿拉伯糖，3：半乳糖，4：葡萄糖，5：甘露糖/木糖，6：果糖。图b为abp3-2的hpaec-pad图谱，1：葡萄糖，2：果糖。

(2)红外光谱分析

如图2所示，由abp3-2红外光谱图可知，abp3-2含有糖聚物的特征吸收峰：3368cm^-1为o-h伸缩振动，2936cm^-1为c-h伸缩振动，1642cm^-1为羰基吸收峰。1740cm^-1区间未见吸收峰说明abp3-2不含有糖醛酸，929cm^-1和815cm^-1为呋喃环的特征吸收峰；871cm^-1处有吸收峰，说明abp3-2为主要由β型糖残基组成。

(3)甲基化/gc-ms分析

abp3-2甲基化分析，经过水解，还原乙酰化后，gc-ms检测，由gc-ms图谱可知，abp3-2含有→1)-β-d-fruf-(2→和→2)-β-d-fruf-(6→糖残基。

(4)核磁共振分析

本试验通过¹hnmr、¹³cnmr、hsqc对abp3-2的糖残基的碳原子和氢原子的化学位移进行归属，然后用hmbc确认其连接顺序。图4-7为abp3-2的¹hnmr、¹³cnmr、hsqc和hmbc图谱。

根据图3-6的核磁图谱可知各个碳和氢的归属，如下表1所示。

表1abw3-1核磁共振分析结果

^aunresolvedfromothersignals.

综上所述：abp3-2是一种由葡萄糖和果糖组成的果聚糖，从甲基化分析说明其含有→1)-β-d-fruf-(2→和→2)-β-d-fruf-(6→糖残基，不同糖残基之间的连接顺序由二维核磁hmbc谱图分析得出，由以上分析得出abp3-2的结构为：

其中n为1～6或8～30。

2.牛膝糖聚合物abw1-1、abp1-2和abp4-3的结构分析

同理，分别对糖聚合物abw1-1、abp1-2、abp4-3的结构进行上述同样的分析，并分别获得以下信息：

(1)由图7-12可知，牛膝糖聚合物abw1-1是由葡萄糖和果糖组成的果聚糖，主链由→2)-α-d-fruf-(1→组成，支链由→2)-β-d-fruf-(6→组成，末端糖残基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf组成，abw1-1结构为：

其中x为2～30，y为2～30。

(2)由图13-18可知，牛膝糖聚合物abp1-2是由葡萄糖和果糖组成的果聚糖，主链由→2)-α-d-fruf-(1→组成，支链由→2)-β-d-fruf-(6→组成，末端糖残基由α-d-glcp-(1→和→2)-β-d-fruf组成，abp1-2结构为：

其中n为1～6或8～30，m为1～11或13～30。

(3)由图19-24可知，牛膝糖聚合物abp4-3是由阿拉伯糖，半乳糖，鼠李糖和半乳糖醛酸组成的杂多糖，主链由→4)-α-d-galpa-(1→和→2,4)-α-d-galpa-(1→组成，支链包括→5)-α-l-araf-(1→、→3)-α-l-araf-(1→、→2,3,5)-α-l-araf-(1→、→6)-β-d-galp-(1→、→3,6)-β-d-galp-(1→、α-l-araf-(1→、α-l-rhap-(1→和β-d-galp-(1→，abpb-3结构为：

其中n为1～30，m为1～30，x为1～30，y为1～30。

试验例二、牛膝糖聚合物纯品的抗骨质疏松作用研究

(一)试验材料：牛膝糖聚合物abw1-1、abp4-3。

(二)试验对象：斑马鱼幼鱼，购于上海南方模式生物科技发展有限公司，60只。

(三)试验方法：

1.实验设计与分组：

本发明采用斑马鱼动物模型，以糖皮质激素泼尼松龙为模型药，建立一种快速，高效的骨质疏松模型。将受精后3天的斑马鱼胚胎暴露于25μm的泼尼松龙溶液中，28.5℃下在6孔板中培养96h，至斑马鱼头部骨骼形成，设模型组、空白对照组、阳性对照组、给药组。用此模型观察牛膝糖聚合物abw1-1及abp4-3对泼尼松龙诱导的骨质疏松的防治作用。各组动物和给药方法见表2，其中阳性药aln为阿仑膦酸钠，阴性对照组为0.1％dmso。造模后暴露给药，给药后连续培养96h。

表2实验设计与分组

2.斑马鱼胚胎收集与培养

控制斑马鱼成鱼日夜节奏，昼夜时间控制在14h:10h，收集斑马鱼受精卵，置于培养皿中，加入培养基(0.2％的速溶海盐溶于去离子水中)，置于恒温培养箱中培养，培养温度为28.5℃。

3.牛膝糖聚物对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型的影响

将受精后3天的斑马鱼幼鱼放入6孔板中，加入培养基，每孔放10条幼鱼，分为阴性对照组，模型组，阳性对照组，给药组，每组做3份。受精后第4天开始根据表2方法给药，将6孔板密封放入28.5℃培养箱中恒温培养96h，培养过程中斑马鱼幼鱼不喂食。

4.钙黄绿素染色

给药结束后，将受精后7天的斑马鱼幼鱼用养鱼水反复冲洗三次，浸没于0.2％的钙黄绿素溶液中5min，然后幼鱼再用养鱼水反复彻底冲洗三次(5min/次)，用0.016％ms-222麻醉致死，用3％的甲基纤维素固定幼鱼，荧光显微镜下观察。5.图像采集以及头部骨骼定量分析

nikonsmz1500荧光倒置显微镜观察钙黄绿素染色的斑马鱼头骨腹面，其配套的成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强和曝光设置，图像最后使用adobephotoshop7.0软件调节处理。专业的形态分析软件nis-elementsd3.1测定受精后7天斑马鱼幼鱼头部骨骼的相对荧光强度rfi(relativefluorescenceintensity)，以反映骨密度。

(四)实验结果

1.泼尼松龙诱导骨质疏松斑马鱼钙黄绿素染色图像

牛膝糖聚合物对泼尼松龙诱导的骨质疏松斑马鱼进行钙黄绿素染色，结果见图25、27。如图所示，25μm泼尼松龙处理后，相对于con组，受精7天后的斑马鱼幼鱼头部骨骼的钙黄绿素的染色面积和染色强度明显减少，说明糖皮质激素泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松模型成功。与pre组比较，牛膝糖聚合物abw1-1以及abp4-3给药组明显增强斑马鱼幼鱼头部骨骼的染色面积以及染色强度，说明牛膝糖聚合物abw1-1和abp4-3对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松具有良好的治疗效果。

2.泼尼松龙诱导骨质疏松斑马鱼相对荧光强度定量分析

牛膝糖聚合物对泼尼松龙诱导骨质疏松斑马鱼头部骨骼的相对荧光强度定量分析见图26、28。如图所示，与con组比较，模型组斑马鱼头部骨骼的相对荧光强度极显著地减少，差异具有统计学意义(p<0.0001)，说明泼尼松龙诱导斑马鱼骨质疏松模型成功。与pre组比较，牛膝糖聚合物abw1-1和abp4-3均可极显著性提高斑马鱼头部骨骼的相对荧光强度，且差异具有统计学意义(p<0.0001)，说明牛膝糖聚合物abw1-1和abp4-3对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松具有良好的治疗效果。

综上所述，本发明制备的牛膝糖聚合物纯品abw1-1和abp4-3均能显著增加糖皮质激素诱导骨质疏松斑马鱼头部骨骼的相对荧光强度，明显增强斑马鱼头部骨骼钙黄绿素染色面积以及染色强度，从而发挥其治疗骨质疏松症的作用。