甜瓜抗白粉病相关SSR标记及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术辅助育种，甜瓜抗白粉病相关ssr标记及其在甜瓜种资选择中的应用。
背景技术：
：甜瓜(cucumismelol.)，属葫芦科甜瓜属，是一年生的蔓性草本植物，染色体2n＝2x＝24，因其经济效益好，种植面积逐年增加，我国甜瓜的播种面积居世界第一。甜瓜白粉病是生产中的世界性病害，对甜瓜的产量和品质具有极其严重影响。因此，培育和推广抗病品种是防治甜瓜白粉病最为经济、有效的措施。而开发甜瓜抗白粉病基因连锁的分子标记也就具有较大意义。近年来的研究表明，我国甜瓜白粉病是由p.xanthii引起的，大多数地区的优势小种为p.xanthiirace1和p.xanthiirace2f。徐志豪等(1999)的研究认为浙江地区甜瓜白粉病的主要致病菌为p.xanthii生理小种2；王娟等(2006)的研究认为引起北京地区主要有p.xanthiirace1和p.xanthiirace2f，优势小种为p.xanthiirace2f；包海青等(2008)的研究表明，海南地区甜瓜白粉病菌的优势生理小种是p.xanthii2f；顾海峰等(2010)的研究认为上海地区的优势生理小种是p.xanthiirace1，p.xanthiirace2f仅在浦东新区发现；咸丰等(2010)的研究认为陕西省甜瓜白粉病的主要致病小种是p.xanthiirace2f；马鸿艳等(2011)的研究表明，黑龙江省存在的甜瓜白粉病致病菌有p.xanthiirace1和p.xanthiirace6，优势小种为p.xanthiirace1；张莉等(2011)的研究表明，甘肃省存在的甜瓜白粉病致病菌有p.xanthiirace1和p.xanthiirace2f，优势小种为p.xanthiirace1；张波等(2011)的研究表明，p.xanthiirace1和p.xanthiirace2f，主流是p.xanthiirace2f；苏瑞(2013)的研究认为北疆地区的甜瓜白粉病优势小种为p.xanthiirace1；李苹芳等(2015)的研究表明，江浙沪地区的甜瓜白粉病优势小种为p.xanthiirace1。有关甜瓜白粉病抗性基因的研究开始较早，甜瓜白粉病的致病小种不同，相应的抗性基因也有所差异，不同的抗病材料含有的抗性基因也可能不同。périn等(2002)白粉病抗性基因pm-x定位在第ii连锁群、pm-w基因定位在第v连锁群、pm-y基因定位在第xii连锁群。perchepied等(2005)发现分别位于第ii与第v连锁群的两个基因。dogimont等(2008)将白粉病抗性基因pm-w定位在第v连锁群上，验证了périn等(2002)的研究结果；同时发现，该基因与抗蚜虫基因vat属等位基因。fukino等(2008)在第ii与第xii连锁群各发现一个抗病位点。teixeira等(2008)研究表明所含的抗性基因pm-1位于第ix连锁群。yuste-lisbona等(2011)将白粉病qtl定位在第v连锁群。wang等(2011)将抗白粉病基因定位在第v连锁群两个共显性分子标记af与ca之间。闫伟丽(2014)将白粉病抗性基因位于甜瓜第ii号连锁群上。ning等(2014)将甜瓜白粉病抗性基因定位在第ii、v连锁群上。陈静(2015)现甜瓜wmr-29品系对白粉病p.xanthiirace1的抗性受两个显性抗病基因控制，该两个基因分别位于lgⅱ、lgxii连锁群上。齐振宇(2015)将甜瓜re-33内抗白粉病基因定位在甜瓜基因组2号染色体135976bp-1418829bp的位置。艾子凌等(2016)将1个甜瓜白粉病抗性相关基因位点定位在第vii连锁群上。wang等(2016)将甜瓜白粉病抗性基因定位在2号染色体上。技术实现要素：本发明提供一种甜瓜抗白粉病相关ssr标记，并提供其在选择对白粉病有抗性的甜瓜种质资源上的应用，为甜瓜抗白粉病基因的精细定位和克隆奠定基础，可在甜瓜材料的任何阶段对其进行白粉病抗性的筛选，具有高效、准确、限制少的有点，可加速抗白粉病的甜瓜品种的选育，加快育种进程。本发明提供的技术方案是：一种检测甜瓜白粉病抗性分子标记的引物对，所述引物对序列如下：ssr168167-f：gtcttcattgccttcctcgtcssr168167-r：cattcgtattcttactccct。本发明还提供所述的引物对在筛选甜瓜抗白粉病种质资源中的应用，其步骤如下：(1)采用所述引物对待选甜瓜品种的基因组dna分别进行pcr扩增，(2)对扩增结果进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；(3)从检测结果中选出扩增出抗白粉病特征条带的材料。上述的应用，所述pcr反应体系为:7.5ngdna，正向和反向引物各50ng，5μlgogreenmastermix，加双蒸水至10ul。所述的应用，所述pcr扩增程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，4℃保存。所述的应用，所述凝胶电泳检测：指采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，点样时使用1.5ul750bpmarker(genstar公司产品)，于150v恒功率电泳分离75min，最后银染显色。本发明还提供所述的引物对在鉴定甜瓜抗白粉病的方法，其步骤如下：(1)采用所述引物对待测甜瓜品种的基因组dna进行pcr扩增，(2)对扩增结果进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；(3)根据扩增条带的有无确定待测甜瓜品种对白粉病的抗性。本发明以感白粉病的“25113”(p1)、抗白粉病的“25117”(p2)为亲本构建六世代群体和甜瓜白粉病病原菌鉴定寄主的进行表型鉴定，又以感白粉病的“11016”(p1)、抗白粉病的“25117”(p2)为亲本构建f2群体及ril群体，并同时种植甜瓜白粉病病原菌鉴定寄主的进行表型鉴定。提取各群体dna，利用bsa法筛选具有多态的标记。将筛选出的标记应用到各个群体中进行验证，把基因型鉴定的结果与田间鉴定的结果进行比较，获得正确率较高的连锁标记。以感白粉病的“25113”(p1)、抗白粉病的“25117”(p2)为亲本构建六世代群体为材料，标记在f2群体中的正确率为98.2％，在b1群体中的正确率为96.7％，在b2群体中的正确率为99.9％；又以感白粉病的“11016”(p1)、抗白粉病的“25117”(p2)为亲本构建f2群体及ril群体为材料进行验证，标记在f2群体中的正确率为98.1％，在ril群体中的正确率为98.1％。通过用与试验材料无血缘关系的其它28份材料验证，标记的正确率为82.1％。本发明不仅为甜瓜抗白粉病基因的精细定位和克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选育抗白粉病的甜瓜新品种提供理论依据。附图说明图1.是甜瓜白粉病发病分级田间调查图示；图2.是ssr标记ssr168167对甜瓜感白粉病的“25113”(p1)、抗白粉病的“25117”(p2)及f1世代的检测结果；图3.是ssr标记ssr168167对甜瓜感白粉病的“11016”(p’1)、抗白粉病的“25117”(p2)及30株抗病单株dna混池(r)、30株感病单株dna混池(s)的检测结果；图4.是ssr标记ssr168167对甜瓜“25113”(p1)、抗白粉病的“25117”(p2)构建的f2群体部分单株的检测结果；图5.是ssr标记ssr168167对甜瓜“11016”(p’1)、抗白粉病的“25117”(p2)构建的f2群体部分单株的检测结果；图6.是ssr标记ssr168167对甜瓜“11016”(p’1)、抗白粉病的“25117”(p2)构建的ril7群体部分单株的检测结果。具体实施方式甜瓜亲本“25113”、“25117”和“11016”，本实验室均有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。“20113”是感白粉的厚皮甜瓜，果实光皮、黄色、桔红肉；“25117”是抗白粉病的厚皮甜瓜，果实有网纹、黑绿皮、橙红肉；“11016”是感白粉病的厚皮甜瓜，果实有网纹、灰绿皮、绿黄肉。ssr引物来自本发明人课题组内根据甜瓜est-ssr序列使用primer5.0软件自行设计引物共61对(引物序列详见下表)。pcr实验使用shanghaipromega公司的greenmastermix；凝胶使用genstar公司的40％非变性聚丙烯酰胺凝胶，将其稀释至8％后使用，点样时使用750bpmarker(genstar公司产品)。实施例1甜瓜抗白粉病相关ssr标记的筛选步骤1.甜瓜白粉病抗性的田间鉴定试验于2016年在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验基地进行，以甜瓜感白粉病的“25113”(p1)、抗白粉病的“25117”(p2)为父母本获得f1、f2及b1、b2群体；2016年春季在中国农业科学院蔬菜花卉研究所实验大棚中种植p1、p2和f1各60株，f2320株，b1100株，b2100株，甜瓜白粉病鉴定寄主各30株。在两叶一心后接种白粉病致病菌，接种方法为：将病原菌孢子悬浮液均匀的喷洒在叶面上。接种15天左右开始调查六世代群体各单株的发病情况，病级调查分为0-5级：(田间发病调查图示见图1)病原菌孢子悬浮液制备方法：用刷子将病叶上的病原菌的分生孢子刷到0.1％的吐温80溶液中，制备孢子悬浮液，用喷壶均匀的喷洒在叶面上，接种最低浓度要求是105个/ml。在种植的六世代群体中，调查白粉病抗性表现，病情级数在3级及以上的记为感病，计算分离比。使用microsoftexcel2012软件进行数据统计分析，使用sas9.2对结果进行卡方测验。结果显示：f1均表现为抗白粉病；在f2群体中，抗病植株与感病植株的分离比例经卡方测验符合3:1，以抗病的“25117”为回交亲本的回交群体全部表现为抗白粉病，而与另一感病的亲本“25113”回交获得的回交群体中，抗病植株数与感病植株的分离比经卡方检验符合1:1。由此可知，白粉病的抗性是由1对核基因控制，抗病对感病为显性。步骤2.白粉病致病菌生理小种的确定对照白粉病致病小种鉴定标准，根据鉴定寄主的抗感病情况，鉴定当季接种的致病菌生理小种：病情指数ri计算：(xi：病害级别；ni：相应病害级别的株数；i：病害分级的各个级别；n：总株数)根据平均病情级数和下列说明，确定种质病毒病抗性级别。1高抗(hr)(ri＜1.0)3抗(r)(1.0≤ri＜2.0)5中抗(mr)(2.0≤ri＜3.0)7感(s)(3.0≤ri＜4.0)9高感(hs)(ri≥4.0)(s表示感病，r表示抗病，nd表示目前尚不明确，h表示杂合)结果显示：2016年春季接种的白粉病2016春季的白粉病生理小种为p.xanthiirace1，秋季的生理小种为p.xanthiirace2f。步骤3.dna提取和ssr分析取甜瓜植株的嫩叶，用改良的ctab(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及各群体各单株的基因组dna。pcr反应体系为:总反应体系10μl,3μldna(2.5ng·μl-1)，正向和反向引物(50ng·μl-1)各1μl，5μlgogreenmastermix(promega公司产品)。pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min，4℃forever。扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，点样时使用1.5ul750bpmarker(genstar公司产品)，电泳缓冲液为0.5×tbe，150v恒功率电泳分离75min，电泳后银染显色，统计带型。步骤4.ssr标记筛选、数据统计主要包括4步：(1)筛选在p1、p2本间表现多态的ssr标记；(2)在f2群体中选取抗白粉病、感白粉病的单株的dna各30个，根据bsa法构建抗白粉病、感白粉病2个近等基因池，筛选多态性引物；(3)利用获得的多态性引物分析f1群体及f2群体、b1、b2群体各单株基因型；(4)将基因型鉴定的结果与表型鉴定的结果相对照，计算ssr标记鉴定的正确率。(5)根据鉴定结果，获得正确率高的分子标记。显性标记的统计方法：母本带型一致的单株记为a，和父本带型一致的记为c，未扩增出的或模糊不清的记为u。利用61对引物(引物序列详见表1)，在父母本间进行多态性筛选(ssr168167标记的筛选结果见图2)，筛选出具有多态的标记31个，多态率50.8％。再结合bsa法进一步筛选，得到6个标记(ssr168167标记的筛选结果见图3)。利用筛选出的多态性标记对“25113”ד25117”组合的f1群体及f2群体、b1、b2群体各单株基因型进行分析(部分单株鉴定结果见图4)，结合调查性状数据得到在各个群体中正确率最高的ssr标记ssr168167。ssr168167引物序列如下：ssr168167-f：gtcttcattgccttcctcgtc；ssr168167-r：cattcgtattcttactccct。实施例2.甜瓜抗白粉病相关ssr标记的验证利用本课题收集另一份感白粉病材料“11016”(p’1)与抗白粉病的“25117”(p2)为父母本获得f’1、f’2及ril群体，甜瓜抗白粉病相关ssr标记ssr168167在的各群体各单株进行验证，以确定标记用于分子标记辅助选择的准确性：该标记在f2群体中的正确率为98.1％(部分单株鉴定结果见图5)，在ril群体中的正确率为98.1％(部分单株鉴定结果见图6)。利用本课题收集的其他与试验材料没有血缘关系的28份材料做进一步验证，这28份材料中表现抗病的13份，表现感病的材料15份。经和所选材料的田间表现型相比，标记在28份材料中共23份材料的带型反映的表型数据与田间调查结果一致，计算正确率为82.1％，其中感病的材料12份扩增出感病基因型条带。本研究中获得了甜瓜抗白粉病相关的ssr标记，不仅为甜瓜抗白粉病基因的精细定位和克隆奠定基础，同时也为利用分子标记辅助选育抗白粉病的甜瓜新品种提供理论依据。当前第1页12