OTUD5的单克隆抗体制备及其在癌症治疗中的用途的制作方法

本发明涉及otud5的单克隆抗体在癌症治疗中的用途，属于医药生物
技术领域：
。
背景技术：
：泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin―proteasomepathway)是细胞内一个重要的蛋白质降解调节系统。通过对底物蛋白的多聚泛素化并经蛋白酶体降解，可以影响或调节多种细胞活动，包括：基因转录、细胞周期调节、免疫反应、细胞受体功能及肿瘤生长、炎症过程等。该途径也是一个被严格调控的可逆过程，其中去泛素化酶的调节就是一个重要的环节。目前研究证实，细胞内广泛存在许多去泛素化酶(deubiquitinatingenzymes，dubs)，主要分为以泛素羧基末端水解酶家族和泛素特异性加工酶家族为主的5种类型。其中out(otubainprotease)家族是重要的家族成员之一。发明人在前期的研究发现，otud1的表达在癌症病人中明显的丢失。发现一些乳腺癌病人otud1的表达很低，这是由于otdu1基因的缺失甚至删除，而且otud1缺失的病人往往和预后不良有关。ras活性的增加和p53表达的缺失往往是恶性肿瘤的特点。已经发现hras的增加和p53的缺失能够协同作用促进在乳腺癌肿瘤中otud1的低表达。重要的是，otud1基因的缺失发生在很多类型的的癌症中，例如胶质瘤和肺癌，说明otud1作为抑癌基因不仅仅局限于乳腺癌。otud1表达低的肺癌病人比otudi表达高的肺癌病人存活时间短。而且，在乳腺癌组织微阵列芯片分析中，otud1和smad7的表达正相关，进一步支持了otud1能够稳定并调节smad7的功能。不仅如此，在异位移植的裸鼠模型中，otud1的缺失与乳腺癌肿瘤密切相关。目前，体内和体外证据都证明otud1在tgf-p/smad诱导的肿瘤转移过程中的重要功能。另外，作为smad7的去泛素化酶，otud1反映了一个新颖的重要的分子机制来调节smad7的活性，从而调控tgf-p/smad信号通路。为了探究otud1在癌症中的临床意义，分析了toga数据库，发现otud1在很多类型中的癌症中都发生了缺失甚至丢失，在胶质母细胞瘤、黑色素瘤和肺癌中丢失的比例都超过了50％。这些结果有力的证明了otud1的丢失能够导致癌症的发展。既然otud1能够调节肿瘤转移，otud1是一个癌症晚期相关的基因。oncomine数据库分析表明otud1的mrna水平在多种癌症类型的病人中高度下调，包括常见的乳腺癌、结直肠癌、肺癌、淋巴癌等。其中在浸润性导管乳腺癌(invasiveductalbreastcarcinoma,idbc)和肺癌(lungadenocarcinoma,la)中，otud1比正常人群下调了2倍多。利用nki295乳腺癌数据库，我们发现低表达的otud1和病人的预后不良正相关。这些特征不仅在乳腺癌中，在toga数据库中，相比于otud1高表达的膀胱癌病人，otud1低表达的膀胱癌病人有更短的生存时间。而且otud1诱导的致癌性反应，从而抑制乳腺癌转移通过去除smad7的泛素化，抑制tgf-β。虽然目前研究的很充分，但是针对其他out家族的研究还没有涉及。特别是针对otud5与癌症的关系以及相应的单克隆抗体还没有涉及，发明人在此提供了一种新的高结合特异性的otud5单克隆抗体。技术实现要素：根据第一方面，本发明从裸鼠体内筛选出otud5作为一个新的乳腺癌转移的抑制基因。本发明提供一种制备治疗乳腺癌转移的药物用途。其中药物未特异性的下调otud5的表达。本发明的另外一方面，所属下调otud5的表达通过干扰或者抗体实现的。本发明另外一方面，提供一种干扰序列，其特异性的针对otud5进行下调表达。所述的干扰序列为sirna，shrna，rnai。本发明另外提供一种单克隆抗体的制备方法。本发明另外提供一种单克隆抗体。在另外一个方面，本发明提供一种otud5-1的单克隆抗体，其重链可变区序列如seqidno：1所示，其轻链可变区如seqidno：2所示。在另外一个方面，本发明提供一种otud5-2的单克隆抗体，其重链可变区序列如seqidno：3所示，其轻链可变区如seqidno：4所示。在另外一个方面，本发明提供一种otud5-3的单克隆抗体，其重链可变区序列如seqidno：5所示，其轻链可变区如seqidno：6所示。在另外一个方面，本发明提供一种otud5-4的单克隆抗体，其重链可变区序列如seqidno：7所示，其轻链可变区如seqidno：8所示。另外一方面针对otud5-4的单克隆抗体的重链可变区进行序列的优化，筛选得到几个效果更好的突变体。本发明高的另外一个方面，其中所述单克隆抗体是抗体片段。优选的，其中所述抗体片段选自scfv片段、fab片段、f(ab’)2片段和fab’片段。附图说明图1裸鼠体内转移模型实验流程图2shrna干扰前后otud5mrna表达变化图图3shrna干扰前后otud5蛋白表达变化图发明的有益效果本发明通过大量的实验和数据分析发现了otud5与乳腺癌的发生和转移表达密切相关，otud5可以作为治疗靶标用于乳腺癌的治疗中的用途。另外，发明人通过提供了改进的otud5单克隆抗体，所述抗体均具有较好的结合特性。具体实施方式实施例1裸鼠体内筛选出otud5作为一个新的乳腺癌转移的相关基因1、裸鼠体内筛选模型本研究中，我们利用裸鼠设计了体内转移模型来筛选能够抑制乳腺癌转移的去泛素化酶，并将它应用于有上皮样性状和低转移能力的mda-mb-231细胞.我们用了靶定75个去泛素化酶的shrna文库(文库通过sigmamissionlibrary以及北京傲锐东源生物科技有限公司购买)，每个去泛素化酶有4-6个不同的shrna，其中至少有两个是被鉴定过有效的。首先，我们利用hek293t细胞包装产生了371种不同的shrna病毒，并将它们感染到足够数量12孔板的mda-mb-231细胞中。48小时后，我们使用浓度为2μg/ml，的puromycin筛选3天后得到371个稳定细胞系。然后我们从每个不同的细胞系中取1万细胞混合在一起，将所有的细胞注射到30只裸鼠心脏中。这些乳腺癌肿瘤细胞会在血液循环过程中穿过血管壁，侵入远端组织，形成骨转移灶或者肺转移灶。5-6周后，我们取下裸鼠中的骨转移灶，并提取这些肿瘤细胞的基因组dna，通过比对测序结果鉴定所提取肿瘤细胞的shrna靶向的去泛素化酶。这个筛选策略能够应用于鉴定抑制肿瘤转移的必需的去泛素化酶(图1裸鼠体内转移模型实验流程)。根据上述方法，将细胞导入小鼠体内5周后，这些混合的细胞系在所有裸鼠中共产生了13个转移灶，包括骨转移和肺转移。相反，注射对照组细胞的裸鼠没有产生任何的转移灶。接下来，我们将这13个转移灶取下，与癌细胞没有转移以及癌细胞几乎没有生长的小鼠进行直接比较，我们提取其中一个细胞增殖能力降低最多的细胞，其中含有的shrna靶向otud5。而otud5是一个含有otu结构域的去泛素化酶，它在癌症中的作用并没有被报道，所以揭示otud5表达降低对于抑制肿瘤转移具有较好的作用。实施例2otud5表达下调抑制乳腺癌肺转移为了验证otud5在肿瘤转移中的作用，我们利用shrna干扰技术(otud5(locusid55593)humanshrna，购买自北京傲锐东源生物科技有限公司)，筛选得到了otud5敲除的mda-mb-231细胞系，从图2可以看出，otud5的mrna表达量降低了80％，图3的蛋白表达量通过作图软件计算，其蛋白表达量降低达到79％。这说明基因敲除细胞构建成功。将这个细胞系注射到裸鼠心脏后，每组30只，一组为没有敲除的mda-mb-231细胞系。通过8周的反应后，导入shrna的细胞系其骨转移只有10％，而没有导入shrna的细胞系其骨转移达到66.7％，这说明了otud5基因的下调能够显著地降低乳腺癌的转移。实施例3otud5单克隆抗体的制备1.稳定表达otud5抗原的cho细胞的产生根据nm_001136157序列，设计引物扩增出人的全长otud5cdna，连接到表达载体pcdna3.1(+)，构建真核表达载体pcdna3.1(+)-otud5。(2)转染cho细胞于3.5cm组织培养皿中接种3x105cho细胞，细胞培养至90％-95％融合时进行转染:取质粒10μg(pcdna3.1(+)-otud5)和20μ1lipofectamine2000reagent(invitrogen公司产品)分别溶于500μ1无血清dmem培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使dna-脂质体复合物形成，其间用3m1无血清的dmem培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的dna-脂质体复合物加入到板中，co:孵箱培养4小时后补加2m1含10％fbs的dmem完全培养基，置于co2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600pg/mlg418的选择培养基培养2周。(3)分选阳性细胞取上述转染细胞，加入fitc-5814℃孵育45min，洗细胞2遍后用流式细胞分选术facsvantage(bdbiosciences,sanjose,ca).来分选高表达otud5的阳性细胞。2.小鼠抗人otud5单克隆抗体的制备(1)免疫小鼠用1x107上述阳性细胞腹腔注射免疫6-8周龄balb/c小鼠，共免疫3-4次，每隔二周免疫一次，细胞数均为1x107/只，融合前3-5天，用1x107细胞/只尾静脉注射进行加强免疫。(2)细胞融合及培养无菌取小鼠脾细胞，制成细胞悬液，将1x107上述阳性细胞和1x108免疫脾细胞混合于50ml离心管中，1000rpm，离心10min，50％peg作融合剂，融合用25m1完全培养基将细胞悬起，滴加于两块96孔培养扳，置37℃7％co2培养箱内培养。细胞融合后，先在完全培养基中作适应性培养，24h后加hat选择培养基作选择性培养，第三天或第十天改为ht培养基。(3)筛选阳性克隆杂交瘤阳性克隆的筛选一般是融合后培养7-10天，取细胞培养上清用流式细胞术检测，筛选高表达克隆:将cho-otud5细胞用1％fcs-pbs重悬成1x106cells/ml，分别加入上述杂交瘤细胞培养上清，置于4℃孵育60min，用1％fcs-pbs洗细胞2遍，然后再加入fitc一羊抗鼠igg(h+l)4℃孵育30min，洗细胞2遍后用fcm分析，比较各个克隆的最大荧光强度。(4)抗体亚型的检测利用小鼠抗体亚型检测试剂盒检测上述筛选出的阳性克隆的亚型。(按照试剂盒的说明书操作)(5)抗体的纯化将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，收集细胞培养上清，用proteing亲和柱分离纯化抗体。将纯化抗体用pbs进行透析，最后以紫外吸收法定量。3.小鼠抗人otud5单克隆抗体的抗原结合活性鉴定(1)用透析标记法标记抗体用0.025mph9.5的碳酸盐缓冲液将预标记的抗体稀释成1％浓度，装入透析袋中。用同一缓冲液将fitc配成0.1mg/ml的溶液盛于小烧杯中，使透析袋浸没于fitc溶液中，在40c避光搅拌24h。取出透析袋中标记液，用sephadexg-50过柱，去除游离荧光素，收集荧光抗体备用。(2)流式细胞术检测抗原结合活性将kg-la细胞用1％fcs-pbs重悬成1x106cells/ml，分别加入不同稀释度的单克隆抗体和作为对照的商品化抗otud5的单克隆抗体(h00055593-m，购自艾美捷科技有限公司)，置于4℃孵育60min，用1％fcs-pbs洗细胞2遍后用fcm分析，计算染色阳性细胞的平均荧光强度并比较各抗体的相对亲和力。这里相对亲和力定义为染色阳性细胞的百分数达到50％时所对应的抗体浓度。具体的，筛选得到4个单克隆抗体，其分别都是igg1亚型，其结合能力，如下表1所示，其中抗体的重链、轻链可变区序列通过测序确定：抗体名称重链、轻链可变区序列kd(nm)kon(m-1sec-1)otud5-1seqidno：1-225.44.52×106otud5-2seqidno：3-420.43.29×106otud5-3seqidno：5-633.55.97×106otud5-4seqidno：7-819.86.64×106h00055593-m对照86.11.02×104实施例4改进的单克隆抗体的制备首先按照本领域常规的试验方法通过本领域常规的重叠pcr技术，分别在重链可变区seqidno：7的区域中进行突变取代，通过400多个取代以及检测，共发现了6个取代形式可以导致单克隆抗体的效果显著提升，其余多种均没有提高或者效果远远差于原始抗体，在此不一一列举。按照本领域常规的抗体活性检测方式，分别检测各个单克隆抗体的活性，结果如表2所示：从表2可以看出，经过改造后的单克隆抗体具有较好的亲和性，比原始抗体具有性能上的改进优势。通过elisa法检测以上抗体与otud5蛋白的结合特性，其最低检测浓度为0.5pg，具有较好的检测效果。实施例5乳腺癌抑制试验将人乳腺癌细胞株接种于rpmi-1640培养液中，培养箱内培养传代，接种于96孔培养板，加入溶解于乙醇生理盐水混合液的单克隆抗体(浓度为30ug.ml-1、50ug.ml-1、100ug.ml-1)48h后mtt法测定生长抑制率。发现在30ug.ml-1时otud5-4，otud5-4-1，otud5-4-2，otud5-4-3，otud5-4-4，otud5-4-5，otud5-4-6，otud5-1，otud5-2，otud5-3，otud5-4，h00055593-m对照的细胞抑制率分别为76.1％，76.9％，77.4％，76.4％，80.5％，76.8％，79.3％，75.1％，75.0％，74.5％，73.8％，40.5％。试验数据表明，本发明的单克隆抗体对乳腺癌细胞有明显的抑制作用。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表〈110〉苏州立豪生物科技有限公司〈120〉otud5的单克隆抗体制备及其在癌症治疗中的用途〈210〉1<212>prt<213>人工序列<400>重链可变区glnilevalleuthrglnserproalaleumetseralaserproglyglulysvalthr15101520metthrargseralaserglnservalsertyrmettyrtrptyrglnglnlysproarg25303540serserprolysprotrpiletyrleuvalserasnleualaserglyvalproalaarg45505560pheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnproleuthrpheglyalagly859095100thrlysleugluleulys105<210>2<212>prt<213>人工序列<400>轻链可变区gluvalgluleuglugluserglyglyglyleuvalglnproglyglysermetlysleu15101520sercysvalalaserglymetthrpheserasnglytrpmetasntrpvalargglnser25303540proglulysglyleuglutrpvalalagluileargserileserasnasntyrvalpro45505560histyralagluservallysglyargphethrileserargaspaspserlysserser65707580valtyrleuglnmetasnasnleuargalagluaspthrglyiletyrtyrcysserphe859095100glyasnserpheasntyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserala105110115〈210〉3<212>prt<213>人工序列<400>重链可变区glnilevalleuthrglnserproalaleumetseralaserproglyglulysvalthr15101520metthrargseralaserglyservalsertyrmettyrtrptyrglnglnlysproarg25303540serserprolysprotrpiletyrleutrpserasnleualaserglyvalproalaarg45505560pheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnproleuthrpheglyalagly859095100thrlysleugluleulys105<210>4<212>prt<213>人工序列<400>轻链可变区gluvalgluleuglugluserglyglyglyleuvalglnproglyglysermetlysleu15101520sercysvalalaserglymetilepheserasnglytrpmetasntrpvalargglnser25303540proglulysglyleuglutrpvalalagluileargserileserasnasntyrvalpro45505560histyralagluservallysglyargphethrileserargaspaspserlysserser65707580valtyrleuglnmetasnasnleuargalagluaspthrglyiletyrtyrcysserphe859095100serasnserpheasntyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserala105110115〈210〉5<212>prt<213>人工序列<400>重链可变区glnilevalleuthrglnserproalaleumetseralaserproglyglulysvalthr15101520metthrargseralaserserserleusertyrmettyrtrptyrglnglnlysproarg25303540serserprolysprotrpiletyrleuthrasnasnleualaserglyvalproalaarg45505560pheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnproleuthrpheglyalagly859095100thrlysleugluleulys105<210>6<212>prt<213>人工序列<400>轻链可变区gluvalgluleuglugluserglyglyglyleuvalglnproglyglysermetlysleu15101520sercysvalalaserglymetthrpheserargglytrpmetasntrpvalargglnser25303540proglulysglyleuglutrpvalalagluileargserileserasnasntyrvalpro45505560histyralagluservallysglyargphethrileserargaspaspserlysserser65707580valtyrleuglnmetasnasnleuargalagluaspthrglyiletyrtyrcysserphe859095100glyasnthrpheasntyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserala105110115〈210〉7<212>prt<213>人工序列<400>重链可变区glnilevalleuthrglnserproalaleumetseralaserproglyglulysvalthr15101520metthrargseralaserserserprosertyrmettyrtrptyrglnglnlysproarg25303540serserprolysprotrpiletyrleuserserasnleualaserglyvalproalaarg45505560pheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnproleuthrpheglyalagly859095100thrlysleugluleulys105<210>8<212>prt<213>人工序列<400>轻链可变区gluvalgluleuglugluserglyglyglyleuvalglnproglyglysermetlysleu15101520sercysvalalaserglymetthrpheserasnglytrpmetasntrpvalargglnser25303540proglulysglyleuglutrpvalalagluileargserileservalasntyrvalpro45505560histyralagluservallysglyargphethrileserargaspaspserlysserser65707580valtyrleuglnmetasnasnleuargalagluaspthrglyiletyrtyrcysserphe859095100valasnserpheasnglytrpglyglnglythrleuvalthrvalserala105110115〈210〉9<212>prt<213>人工序列<400>重链可变区glnilevalleuthrglnserproalaleumetseralaserproglyglulysvalthr15101520metthrargseralasersergluvalsertyrmettyrtrptyrglnglnlysproarg25303540serserprolysprotrpiletyrleuthrserasnleualaserglyvalproalaarg45505560pheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnlystrpserserasnproleuthrpheglyalagly859095100thrlysleugluleulys105〈210〉10<212>prt<213>人工序列<400>重链可变区glnilevalleuthrglnserproalaleumetseralaserproglyglulysvalthr15101520metthrargseralaserserserprosertyrmettyrtrptyrglnglnlysproarg25303540serserprolysprotrpiletyrilethrserasnleualaserglyvalproalaarg45505560pheserglyserglyserglythrsertyrserleuthrilesersermetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnproleuglypheglyalagly859095100thrlysleugluleulys105〈210〉11<212>prt<213>人工序列<400>重链可变区glnilevalleuthrglnserproalaleumets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