本发明涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于检测膀胱癌的rt-qpcr试剂盒及检测方法。
背景技术：
膀胱癌是人体最常见的恶性肿瘤之一，其恶性度高，侵袭性强，易复发和远处转移，给临床治疗带来很大困难。但早期发现和治疗，5年的存活率大于90％，因此早期诊断是提高膀胱癌治疗效果和患者远期生存的关键。
目前膀胱癌的诊断和术后随访主要依靠尿脱落细胞检查和膀胱镜检查。但尿脱落细胞检查的敏感性低，尤其是低级别的肿瘤，因此膀胱癌的诊断仍依赖膀胱镜检加活检，膀胱癌术后随访也主要依赖膀胱镜检查。膀胱镜检查敏感性和准确度虽然都很高，但是具有创伤性，给病人带来不少痛苦。
肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途径，肿瘤标志物试剂盒在膀胱癌早期诊断及筛查中起到至关重要的作用。
因此，寻找膀胱癌肿瘤标志物来早期发现或诊断膀胱癌是当前膀胱癌研究中的热点。最新研究表明，尿上清中存在大量dna或rna标记物，因此检测尿液中dna或rna标记物有望为膀胱癌的诊断提供一个新方法。
虽然已经有30多种尿液标记物可用于膀胱癌的诊断，但是用于诊断膀胱癌试剂盒只有：urovyv50(fish方法)，nmp-22(elisa方法)，bta(elisa)，immunocyt(elisa)；而且这些方法都或多或少存在敏感性不高，假阳性率和假阴性率过高的问题，无法取代膀胱镜检查。目前国际市场用于膀胱癌诊断且敏感性较高的仅有cxbladder(rna诊断)试剂盒，该试剂盒检测尿脱落细胞中rna标记物：cdc2，hoxa13，mdk，igfbp5和cxcr5其敏感性达到83％，特异性达到85％，可以作为膀胱镜检查的补充。
总的来说，现有膀胱癌诊断试剂盒的灵敏性及准确性都偏低，临床意义有限，满足不了早期诊断的要求。为了提高膀胱癌的早期诊断，提高术后生存率，改善病人生存质量，有必要开发新的肿瘤标志物并进行产业化，制备一种灵敏度高、准确性强、使用方便、价格便宜且高效的膀胱癌诊断及术后监护的诊断试剂盒。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足之处，提供一种敏感性及特异性优良的用于检测膀胱癌的rt-qpcr试剂盒。
本发明另一目的是提供一种用于检测膀胱癌的rt-qpcr检测方法。
为解决上述的技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于检测膀胱癌的rt-qpcr试剂盒，包括检测survivin基因的引物：
survivin正向引物：atgggtgccccgacgttgc；
survivin反向引物：ccctccaagaagggccagtc；
survivin特异性探针：ccctttctcaaggaccacc-。
一种用于检测膀胱癌的rt-qpcr检测方法,其包括的步骤如下：
(1)取30ml尿液离心(其中转速2000rpm，时间10分钟，温度4℃)，收集上清液放入另一试管；
(2)取5ml上清液加入1mlexoquick的exosome提取液，在4℃孵化12小时，混合液离心后(转速为1500g，时间为30分钟)使得exosome沉淀在试管底，去除上液后用100ul不含rnaase(核糖核酸酶)水悬浮exosome；
(3)在exosome试管中加入700ulqiazol洗脱液，震荡后加入120ulchloroform(三氯甲烷)；离心(转速14000rpm，时间15分钟，温度4℃)后取上清，加入同体积的体积比浓度为100％酒精；把混合液放入rna纯化柱，离心后加700ul洗涤液，离心后再用500ul洗涤液洗一次，最后加入15ul不含rnaase水，离心收集rna的液体，取2ul测rna的质量与数量；
(4)用一步法rt-qpcr测定survivin
正向引物：atgggtgccccgacgttgc
反向引物：ccctccaagaagggccagtc
tagman探针：ccctttctcaaggaccacc-
pcr混合物使用为：25ul的2xmix，1ul的正向引物(10um)，1ul的反向引物(10um)，1ultagman探针(10um)，1ul的taq酶；
pcr反应的条件为：95℃，15分钟，95℃，2分钟后进行40个循环，95℃，15秒，60℃30秒。
与现有技术相比，本发明的具有如下有益效果：
(1)本发明可以同时检测survivin在尿脱落细胞和尿液离心后上清液中exosomerna的表达，灵敏性和准确性都将近90％，大大提高膀胱癌的早期诊断率，有效减轻患者痛苦，节约患者治疗开支，降低膀胱癌死亡率。
(2)本发明既可用于膀胱癌的诊断和鉴别诊断，又可用于膀胱癌治疗后的复查和高危人群的筛查，具有广阔的应用前景。
(3)本发明是对现有肿瘤诊断试剂行业有力的补充，且将肿瘤诊断试剂水平提升到一个新高度，对行业的发展及技术进步产生深远影响。
具体实施例
为了更好地阐述本发明内容，下面用若干较佳的具体实施例进行说明。但这些具体实施例只是为了说明本发明的内容，而不是对本发明内容进行限制。原理说明
exosomes(中文名外泌体，因其形态而得名)，是细胞外泌囊泡中体积较小的一种，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100nm。外泌体于1983年即被发现，但一直被认为是一种细胞废弃物。最近发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其它细胞从而影响其它细胞的功能。这些发现点燃了人们对细胞分泌膜泡的兴趣。最近的研究发现外泌体在很多生理病理上起着重要的作用，如免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等。不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。
而尿上清中有大量从癌细胞分泌出来的exosomes，这些exosomes含有大量rna或dna标记物。
本发明从众多的标记物中筛选出与cxbladder的标记物完全不同的survivin。survivin在膀胱癌中有较高表达。可大大提高诊断的敏感性和特异性。，本发明可同时检测和survivin在尿细胞和上清中exosomerna的表达，开辟了一种全新的膀胱癌诊断与术后随访监测的方法。
survivin(生存素)基因是一种重要的凋亡抑制基因，具有独特的分子结构及生物学功能。在细胞凋亡、细胞周期的调节和血管形成中有着关键作用。而且survivin作为凋亡抑制蛋白家族的成员，在正常组织中无表达，但在多种肿瘤组织中高表达，且与肿瘤进展和术后判断有关，在膀胱癌中有较多研究。survivin在膀胱癌ⅰ、ⅱ、ⅲ级表达分别为55％、75％、81％。说明恶性程度越高survivin表达越丰富。即survivin在膀胱癌中有高表达，可以大大提高诊断的敏感性和特异性。
一种用于检测膀胱癌的rt-qpcr试剂盒，包括检测survivin基因的引物：
survivin正向引物：atgggtgccccgacgttgc；
survivin反向引物：ccctccaagaagggccagtc；
survivin特异性探针：ccctttctcaaggaccacc-。
一种用于检测膀胱癌的rt-qpcr检测方法,其包括的步骤如下：
(1)取30ml尿液离心(其中转速2000rpm，时间10分钟，温度4℃)，收集上清液放入另一试管；
(2)取5ml上清液加入1mlexoquick的exosome提取液，在4℃孵化12小时，混合液离心后(转速为1500g，时间为30分钟)使得exosome沉淀在试管底，去除上液后用100ul不含rnaase(核糖核酸酶)水悬浮exosome。
(3)在exosome试管中加入700ulqiazol洗脱液，震荡后加入120ulchloroform(三氯甲烷)；离心(转速14000rpm，时间15分钟，温度4℃)后取上清，加入同体积的体积比浓度为100％酒精；把混合液放入rna纯化柱，离心后加700ul洗涤液，离心后再用500ul洗涤液洗一次，最后加入15ul不含rnaase水，离心收集rna的液体，取2ul测rna的质量与数量；所述洗涤液可以选用体积比为70％乙醇溶液。
(4)用一步法rt-qpcr测定survivin
正向引物：atgggtgccccgacgttgc
反向引物：ccctccaagaagggccagtc
tagman探针：ccctttctcaaggaccacc-
pcr混合物使用为：25ul的2xmix，1ul的正向引物(10um)，1ul的反向引物(10um)，1ultagman探针(10um)，1ul的taq酶；
pcr反应的条件为：95℃，15分钟，95℃，2分钟后进行40个循环，95℃，15秒，60℃30秒。
用ct值确定反应的阴阳性。
通过临床验证，结果见下表：
结果表明，survivin对膀胱癌的敏感性和特异性分别为88.2％和82.6％；
上表在对50多例膀胱癌的尿脱落细胞的rt-qpcrsurvivin的检测显示，其敏感性及特异性均将近90％。同时对尿脱落细胞和尿液离心后上清的exosome进行检测可提高敏感性，因尿液中含有大量的肿瘤exosomes，尿exosomerna应为膀胱癌病人液体活检(liquidbiopsy)最佳途径。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。