本发明涉及一种酵母菌和以微生物发酵的方式制备3-吲哚丁酸的方法。
背景技术：
3-吲哚丁酸（iba）和3-吲哚乙酸（iaa），均是天然存在于植物体内的生长素，能促进细胞分裂与细胞生长，诱导形成不定根，增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。广泛应用于农林业生产。3-吲哚丁酸的化学合成方法已有较多报道，目前主要以两种方法，一是由吲哚与γ-丁内酯在四氢萘的回流温度下缩合得到，二是由吲哚与格氏试剂及α-氯代丙腈反应，制得3-丁腈吲哚，再由naoh水解并与盐酸反应制得。化学合成法步骤较多，反应需高温及强酸强碱参与，对环境污染大。关于3-吲哚丁酸的生物合成，ludwig-muller等发现玉米幼苗能将3-吲哚乙酸（iaa）转化为3-吲哚丁酸（iba），根系发达的玉米品种比生根能力弱的玉米品种具有更高的将iaa转化为iba的能力（ludwig-müllerj,epsteine.occurrenceandinvivobiosynthesisofindole-3-butyricacidincorn(zeamaysl.)[j].plantphysiology,1991,97(2):765-770.）；用标记的iaa供给无菌培养的拟南芥幼苗，产生一种与ibafr值相似的标记化合物，随后iba含量很快下降，形成iba结合物（ludwig-müllerj,epsteine.indole-3-butyricacidinarabidopsisthalianaiii.invivobiosynthesis[j].plantgrowthregulation,1994,14(1):7-14.）。由于iba比iaa具有相对较好的稳定性，具有更好的促生能力，因此利用微生物将iaa转化为iba是一条可行的途径。关于微生物发酵制备iba未见相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的是从植株根际土壤分离筛选一种具备合成3-吲哚丁酸功能的酵母菌。
本发明的另一目的是提供一种通过上述酵母菌发酵制备3-吲哚丁酸的方法。
本发明是这样实现的：
具备合成3-吲哚丁酸功能的酵母菌，拉丁名称为saccharomycessp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2017年4月11日，保藏编号：cgmccno.14011。
所述的酵母菌在发酵制备3-吲哚丁酸上的应用，其特征在于该酵母菌进行连续培养，添加培养基和底物3-吲哚乙酸，制备3-吲哚丁酸。
所述的酵母菌在发酵制备3-吲哚丁酸上的应用，其特征在于将该酵母菌接种到含合成-吲哚乙酸的底物的发酵液中，进行连续发酵，从而合成3-吲哚丁酸。
所述的酵母菌在发酵制备3-吲哚丁酸上的应用，其特征在于将该酵母菌接种到产-吲哚乙酸的微生物发酵液中，补充营养物质继续发酵，从而合成3-吲哚丁酸。
本发明所述的酵母菌具备合成3-吲哚丁酸功能，发酵制备iba条件温和，环境友好，解决了化学合成工艺复杂，环境污染等问题。
具体实施方式：
实施例1：
本发明酵母菌saccharomycessp.，详细分离筛选步骤如下：
（1）样品采集：采取根系发达的植株根际土壤。
（2）菌株分离：称取上述土样10g置于盛有100ml无菌水的250ml灭菌三角瓶中，置28℃摇床中振荡半小时得悬浮液，再用无菌水逐步将悬浮液稀释至10-3，10-4，10-5三种稀释度待用，分别取0.1ml上述稀释悬浮液涂布于含固体pda培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置28℃温箱中培养一周，长出的菌株纯化后做后续试验。固体pda培养基配方如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15~20、自来水1000毫升、自然ph。
（3）具有合成iba功能的菌株筛选：将步骤（2）中得到的各个菌株分别接种于有50ml液体pda培养基的三角瓶中，并置于28℃摇床培养，转速为150rpm，培养2d后，按200mg/kg的量添加iaa到液体培养基，继续培养2d后离心取上清液通过液相色谱测定是否有iba，选取有iba的菌株为具有合成iba功能的菌株。液体pda培养基配方如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、自来水1000毫升、自然ph。
（4）菌株合成iba性能鉴定：将步骤（3）分离到的具有合成iba功能的菌株转接到盛有50ml液体pda培养基的250ml三角瓶中培养至稳定期，添加3-吲哚乙酸iaa继续培养后测定iba得率。不同时间重复3次以上操作。结果表明，具有合成iba功能的菌株的iba得率为添加iaa含量的65%-70%，性能稳定。
（5）具有合成iba功能的酵母菌有如下特征：
菌落形态特征：液体pda培养基上菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐。
（6）菌株的分类鉴定：利用its序列鉴定，即酵母its序列通用引物进行pcr扩增并测序，再与国际ncbigenbank（www.ncbi.nlm.nih.gov）核苷酸数据库比对，核苷酸同源性为99%，结合菌落、菌体形态特征鉴定为酵母菌（saccharomycessp.）。于2017年4月11日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)登记保藏，其保藏号为cgmccno.14011，自编号：ly1。
实施例2：
具有合成iba功能的酵母菌连续培养在合成iba上的应用。
（1）从斜面保藏管接种一环酵母菌ly1到50ml液体pda培养基中，置28℃摇床中，150rpm振荡培养到指数期，作为一级种子液；液体pda培养基配方如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、自来水1000毫升、自然ph，
（2）取步骤（1）中得到的种子液，以5%体积的接种量接种到20l发酵罐的液体pda培养基中，28℃通气培养到指数期，作为二级种子液，
（3）将二级种子液接种到200l发酵罐的ypda培养基中，培养至稳定期，添加重量百分浓度为0.8%浓度的3-吲哚乙酸溶液（3-吲哚乙酸用饱和碳酸氢钠溶液溶解或少量乙醇溶解），调节ph至6.5，温度28℃，发酵罐压力0.05-0.08mpa、溶氧40-80mg/kg，发酵12h后将溶氧降低到0-10mg/kg，继续培养12h，放出发酵液，补充ypda培养基按以上操作参数进行连续发酵。ypda培养基为：20g蛋白胨、10g酵母浸粉、2g葡萄糖，适量水溶解后加入15ml0.2%腺嘌呤溶液，定容到1l，
（4）放出的发酵液进行减压浓缩至原体积的五分之一加酸调节ph至灰白色结晶析出，抽滤、水洗后烘干即的iba，iba得率为iaa添加量的68%，提取iba后的滤液调节ph至中性可制成液体肥料，无废弃物排放，安全环保。
实施例3：
该具有合成iba功能的菌株种到产iaa的微生物发酵液中合成iba的应用。
（1）微生物发酵iaa：将产iaa菌株-肠杆菌ly6（保藏编号cgmccno9539）接种到培养基（胰蛋白胨0.8%、酵母膏0.4%、nacl0.7%、葡萄糖2%、果糖0.7%、l-色氨酸0.12%、丙酮酸钠0.02%、硫酸铜0.01%、水1l，ph7.2），发酵完成后灭菌15分钟，灭菌后的发酵液用于该具有合成iba功能的酵母菌合成iba。
（2）酵母菌种子液制备：从斜面保藏管接种一环该酵母菌ly1到50ml液体pda培养基中，置28℃摇床中，150rpm振荡培养到指数期，作为一级种子液；将一级种子液以5%体积的接种量接种到20l发酵罐的液体pda培养基中，28℃通气培养到指数期，作为二级种子液。液体pda培养基配方如下：马铃薯200克、葡萄糖20克、自来水1000毫升、自然ph。
（3）ypda培养基浓缩液制备：分别称取100g蛋白胨、50g酵母浸粉、10g葡萄糖，加入适量水溶解后加入75ml0.2%腺嘌呤溶液，定容到1l，配制成10倍ypda培养基浓缩液，灭菌后装入发酵罐补料系统。
（4）二次发酵：将步骤（2）的酵母菌二级种子液和步骤（3）的ypda培养基浓缩液分别按2%~5%的比例（v:v）泵入步骤（1）已灭菌的发酵液中，调节ph至6.5，温度28℃，发酵罐压力0.05-0.08mpa、溶氧40-80mg/kg，发酵20h后将溶氧降低到0-10mg/kg，在ypda培养基继续培养8h，放出二次发酵液。ypda培养基为：20g蛋白胨、10g酵母抽提物、2g葡萄糖，适量双蒸水溶解后加入15ml0.2%腺嘌呤溶液，定容到1l。
（5）放出的发酵液进行减压浓缩至原体积的四分之一加酸调节ph至灰白色结晶析出，抽滤、水洗后烘干即得iba。提取iba后的滤液调节ph至中性可制成液体肥料，无废弃物排放，安全环保。
实施例4：
该具有合成iba功能的菌株接种到含合成iaa的底物的培养基中，进行连续发酵，从而合成iba的应用。
（1）酵母菌一级二级种子液制备：方法同实施例2的（1）和（2）。
（2）含合成iaa的底物的培养基配制：l-色氨酸2%、丙酮酸钠0.2%、硫酸镁0.01%、20g蛋白胨、10g酵母浸粉、2g葡萄糖，适量水溶解后加入15ml0.2%腺嘌呤溶液，定容到1l（其中l-色氨酸为合成iaa的底物）。
（3）将二级种子液接种到200l发酵罐的含合成iaa的底物的培养基中，维持ph至6-7，温度28℃，发酵罐压力0.05-0.08mpa、溶氧40-80mg/kg，搅拌速度160r/min，发酵36h后将溶氧降低到0-10mg/kg，搅拌转速60r/min继续培养12h，放出发酵液
（4）放出的发酵液的浓缩结晶得iba，滤液处理同实施例2的（4）。
上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。