一株来源于蚕沙的菌株BacillussubtilisSEM‑9及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株来源于蚕沙的菌株bacillussubtilissem-9及其应用。

背景技术：

枯萎病是一种毁灭性的土传病害，有植物“癌症”之称。引起该病的病原主要是镰刀菌，寄主范围广泛，可引起100多种植物发生病害。长期以来，人们对病害的防治手段主要有作物轮作、选育抗病品种、化学药物防治和生物防治等。抗病品种选育周期长且易失去抗性，化学药物虽然具有防效高、速度快、杀虫抗菌谱广、成本低及使用简单等优点，但长期使用化学药剂易导致土质退化、病原菌产生抗药性，造成次要病害猖獗、药剂残留、环境污染等严重生态和农产品安全问题。近年来人们对于食物安全的重视和环保意识的增强，对农业的可持续发展提出了更高的要求。生物防治因其低成本、高效率、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外植物病害防治的研究热点。

生物防治主要是通过拮抗微生物土壤定殖，与病原菌竞争营养及生存空间、分泌抑菌物质及蛋白酶、激发植物体的抗性免疫机制、促进植物生长、强化抗逆性等综合作用形成对土传病害的预防与防治效果。

蚕沙是养蚕生产中的主要有机废弃物，不但含有丰富的营养物质，还含有丰富的微生物菌群，例如固氮、解磷和解钾及其病原拮抗的微生物菌群。因此如何分离筛选并有效利用其中的微生物资源，成为本研究的关注重点。

技术实现要素：

基于以上现有技术，本发明的首要目的在于提供一株来源于蚕沙的菌株bacillussubtilis(枯草芽孢杆菌)sem-9。

本发明的另一目的在于提供上述bacillussubtilissem-9在制备拮抗镰刀菌微生物菌剂或蚕沙微生物菌肥中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一株来源于蚕沙的菌株bacillussubtilissem-9，已于2017年5月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmccno.60169。

上述枯草芽孢杆菌sem-9是从蚕沙中分离纯化后得到，其性状如下：

菌落形态：本发明的枯草芽孢杆菌sem-9菌悬液经涂板与na培养基后，37℃生化培养箱中培养3天，观察其菌落形态特征，结果如图1所示。由图1可见，本发明的枯草芽孢杆菌sem-9菌落乳白色，圆形，表面皱褶，不透明，边缘不整齐。

将本发明的枯草芽孢杆菌sem-9按1％比例接种于nb培养基，37℃摇床中培养14h后，取悬液，点样到载玻片、烤片，经革兰氏染色，油镜观察菌株的形态特征，结果如图2所示。由图2可见，本发明的枯草芽孢杆菌sem-9为革兰氏阳性菌，芽孢中生，为椭圆形，菌体为杆状。

上述bacillussubtilissem-9在制备拮抗镰刀菌微生物菌剂中的应用。

优选地，所述拮抗镰刀菌微生物菌剂是指微生物菌液或微生物原粉。

优选地，所述微生物菌液通过如下方法制备得到：

将枯草芽孢杆菌sem-9菌种活化，发酵，得到活芽孢含量为50～60×10⁸cfu/ml的枯草芽孢杆菌sem-9菌液。通过灌根或者叶面喷洒的方法，可以有效防治作物枯萎病。

优选地，所述微生物原粉通过如下方法制备得到：

将枯草芽孢杆菌sem-9菌种活化，发酵，得到活芽孢含量为50～60×10⁸cfu/ml的成熟发酵菌液，经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙搅拌混合均匀，得到液固混合物，喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌sem-9原粉。

优选地，所述枯草芽孢杆菌sem-9原粉的活菌浓度为5～6亿/克干粉。

优选地，所述轻质碳酸钙的加入量为浓缩后的成熟发酵菌液质量的3％。

上述bacillussubtilissem-9在制备蚕沙微生物菌肥中的应用，所述应用过程为：将枯草芽孢杆菌sem-9原粉与蚕沙或堆肥腐熟后的蚕沙、烟梗和贝壳粉混匀，得到蚕沙微生物菌肥。

优选地，所述蚕沙微生物菌肥中各组分的质量百分含量为：枯草芽孢杆菌sem-9原粉1％～10％，蚕沙或堆肥腐熟后的蚕沙60％～80％，烟梗10％～20％，贝壳粉10％～30％，所有组分之和为100％。

本发明的菌株具有如下优点及有益效果：

(1)本发明的bacillussubtilissem-9菌株来源于蚕沙，为蚕沙堆肥过程中的自生菌，与蚕沙有机肥的配合性好；

(2)本发明的bacillussubtilissem-9菌株可以高效抑制枯萎病、根腐病等作物土传病害的发生，起到防治作物病害和提高作物抗病虫害能力的作用，从而提高作物的产量和品质；

(3)本发明的bacillussubtilissem-9菌株耐高温性好，在60度高温下培养和运输均可以存活，在土壤微生物菌剂制备方面具有相当的优势；

(4)本发明的bacillussubtilissem-9菌株耐盐碱性好，可以在7％的nacl浓度及ph5～9的范围内生长良好，在盐碱地改良方面具有相当的优势。

附图说明

图1为本发明bacillussubtilissem-9的菌落形态特征图；

图2为本发明bacillussubtilissem-9的菌株形态特征图；

图3为本发明bacillussubtilissem-9在不同温度下的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

bacillussubtilissem-9菌株的分离及鉴定

(1)样品稀释：从发酵腐熟的蚕沙堆肥中取样，称取5g溶解到装有45ml无菌水的三角瓶中，150rpm振荡器振荡成均匀的10^-1稀释液，然后用1ml移液枪吸取该稀释液1ml至装有9ml无菌水的试管中，充分摇匀，即制成10^-2的样品稀释液，并依次稀释至10^-6。

(2)培养基准备：

解无机磷筛选培养基：葡萄糖10.0g、ca3(po4)25.0g、(nh4)2so40.5g、nacl0.2g、kcl0.2g、mgso4·7h2o0.1g、feso4·7h2o0.03g、mnso4·4h2o0.03g、酵母粉0.5g、蒸馏水1000ml、ph6.8～7.2，灭菌20min；

马铃薯土豆培养基：马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1000毫升、ph6.8～7.2；

na培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，ph7.0；121℃灭菌20min，于45℃-55℃倾倒至无菌的培养皿。

(3)菌种分离、纯化与筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1ml，均匀涂布于冷却好的解无机磷培养基，放置30℃培养箱中倒置培养5天，观察并挑选长势良好、解磷圈显著的菌落于na培养基培养；将所挑选出菌于na培养基多次继代培养后，通过平板对峙法，检测与镰刀菌的拮抗效果，取拮抗效果显著的一个菌株，即为bacillussubtilissem-9菌株。

(4)菌株的鉴定

a、形态鉴定：枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9菌株的菌落形态为乳白色，圆形，表面皱褶，不透明，边缘不整齐。革兰氏染色结果表明bacillussubtilissem-9为革兰氏阳性菌，芽饱椭圆形、中生，菌体为杆状。

b、基因组测序比对分析：sem-9的全基因组序列经illuminahiseq4000平台测序分析发现，sem-9的基因组含有4,218个基因，总长度为3,638,439bp，平均长度863bp，占基因组全长的88.27％。串联重复序列共53个，总长为3,754bp，占基因组全长的0.0911％。小卫星序列40个，微卫星序列2个。trna86个，rrna30个。其16srrna基因片段长度为1401bp，与多株bacillussubtilisstrain相似性达99％以上，具体序列见序列表。

(5)菌株sem-9鉴定结论

根据菌株sem-9的形态学及基因组数据比对分析，鉴定sem-9为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，已于2017年5月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmccno.60169。保藏地址：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码为510075。

(6)菌株拮抗镰刀菌效果测定：

采用平板对峙法，在平板中央分别接种枯萎病病原菌尖孢镰刀菌，fusariumoxysporum，在距其约1.5cm处放置滤纸片(去除表面活性剂，肥皂水浸泡，冲洗干净，烘干，灭菌)，点5ul枯草芽孢杆菌sem-9的发酵液，待完全吸收后，倒置培养2-3天，观察，其对镰刀菌菌落半径抑制率。结果表明：枯草芽孢杆菌sem-9对所测尖胞镰刀菌有非常显著的拮抗效果，菌落半径抑制率达74％左右。

镰刀菌孢子发芽率抑制实验：制备1～3×10⁷cfu/ml浓度的尖胞镰刀菌孢子悬液。将本发明的菌株发酵液冷冻干燥，冻干粉与pdb培养基配制0.1g/ml浓度的发酵液，该发酵液分别与pda培养基按比例配制12.5％，25％和50％体积浓度的培养液。接种孢子终浓度为10⁶cfu/ml，并分别在6h、12h和24h统计镰刀菌孢子的发芽率。结果如表1所示。

表1sem-9发酵液对尖胞镰刀菌孢子发芽率的影响

由表1可知，随着发酵液浓度升高，对镰刀菌孢子的发芽抑制效果也增强，与对照相比，孢子发芽抑制率可达70％～80％。

(7)菌株耐高温及盐碱度测定：

耐高温测试：将本发明菌株活化后，1％的比例接种到离心管里，分别在37℃，50℃和60℃，转速200rpm的条件下培养，检测其在od600nm的生长曲线，结果如图3所示。结果表明：在50℃和60℃高温下，本发明的菌株都能正常生长，只是生长有2～4h的延滞。

耐盐碱度测试：将本发明菌株活化后，按1％的比例分别接种到ph范围在3～10的培养基里，及含nacl浓度1～10％的培养基中，37℃，200rpm培养过夜，看菌株生长情况。结果发现本发明sem-9菌株在ph5～9的范围内及nacl浓度7％以内正常生长。

实施例2

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9菌液、菌剂原粉及蚕沙微生物菌肥的制备：

(1)活化菌种

活化枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9菌株，从斜面中挑取菌落并在na固体培养基划线培养，培养条件37℃，待sem-9在na固体培养基上生长18-24h后，挑取单菌落，用于一级种子液的制备；

(2)一级种子液的制备

选取na固体培养基上的单菌落，接种于一级种子摇瓶中，摇瓶体积为250ml，一级种子nb液态培养基(121℃下，灭菌20min)的装液量100ml，将一级种子摇瓶在37℃、200r/min下培养14h，得到一级种子液；

(3)二级种子液的制备

种子罐中的培养基仍为nb液体培养基，121℃下，灭菌20min，将一级种子液接入种子罐中，接种量为0.7～1％(v/v)；培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为250～400r/min，培养温度32℃，罐压0.05mpa，培养时间为12小时，培养结束时得到二级种子液，其活菌含量为1～3×10⁷cfu/ml，od值在0.8～0.9左右，此时菌种活力强；

(4)枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9的菌液发酵

发酵培养基配方(重量百分比)：玉米淀粉2-3％g；豆粕粉1.5-2.5％；酵母膏0.5～1％，caco30.3-0.6％，k2hpo40.02-0.03％，mgso4·7h2o0.015-0.025％，mnso4·h2o0.015-0.025％，(nh4)2so40.05-0.15％；ph6.5-7.5，121℃灭菌20min；

将枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9的二级种子液，按照接种量为0.5～1％(v/v)接入发酵罐中，培养条件为：接种量为0.5-1％(v/v)，培养条件为：通气比1:(1-1.5)，搅拌转速为200-400r/min，培养温度32℃，罐压0.05mpa，保持5％以上的溶氧条件，培养时间为48h左右；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中枯草芽孢杆菌sem-9活芽孢含量为10～50×10⁸cfu/ml，得到发酵成熟菌剂；

(5)枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9原粉的制备

步骤(4)所得的发酵成熟菌剂(活芽孢含量为50～60×10⁸cfu/ml)经碟片离心机或微滤设备浓缩后，加入轻质碳酸钙，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，将该液固混合物搅拌30min后，利用输料泵将液固混合物送入离心式喷雾塔中干燥，得到枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9原粉。

所得枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9原粉中活菌浓度为5～6亿/克干粉。

(6)枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9蚕沙微生物菌肥的制备

将步骤(5)所得枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)sem-9原粉按比例与蚕沙或堆肥腐熟后的蚕沙、烟梗和贝壳粉混匀，获得蚕沙微生物菌肥。所述蚕沙或堆肥腐熟化处理后的蚕沙、sem-9原粉、烟梗和贝壳粉的质量百分含量分别为60％～80％、1％～10％，10％～20％和10％～30％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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