一种具有抗氧化活性的罗非鱼皮明胶肽的制备方法与流程

本发明涉及罗非鱼皮明胶肽的制备方法，更具体地说，涉及一种具有抗氧化活性的罗非鱼皮明胶肽的制备方法。

背景技术：

罗非鱼俗名非洲鲫鱼，属鲈形目、鲡鱼科，具有生长快、食物杂、抗逆性强、繁殖快、肉质好、易养殖、产量高等特点。在我国淡水养殖品种中产量提高较快。目前，罗非鱼的生产加工主要以出口冷冻鱼肉片为主，加工过程产生的下脚料占全鱼重的60％～70％，这其中包括鱼皮、鱼头、鱼鳍和鱼骨。这些下脚料若不进行有效利用，不但会造成极大的浪费，甚至还会对环境造成污染。合理开发和利用这些下脚料，可以有效促进罗非鱼在养殖、加工产业方面的良性发展；另一方面，鱼皮中含有丰富的蛋白资源且其安全性高、生物性状良好，近年来的大量研究结果表明，从鱼类资源中提取的明胶具有较好的生物相容性、生物降解性和弱抗原性，最重要的是其安全性高。另外，鱼皮、鱼骨、鱼鳞等是鱼类产品加工的主要副产物，合理地研究和开发鱼类明胶，不但可以提高鱼类的整体利用价值，减少环境污染，还可以拓宽各个领域所需明胶的原料来源，同时也增加了大众对于明胶产品的选择性，具有重要的经济价值与理论意义。鱼皮明胶经酶解制备成的明胶肽具有较高的血管紧张素转化酶抑制作用及抗氧化、免疫调节和抗菌活性。且富含多种氨基酸，不含脂肪，能够满足人们对“低脂高蛋白”这一类食品的需求。鱼皮中的明胶肽，可增强在低钙水平下的骨胶原结构，进而增强骨强度，起到预防骨质疏松症的作用，同时还可以加强皮肤中的胶原代谢的速度，达到美容的效果，此外还能够改善与老化相关的胶原合成低下问题，对关节症等胶原病也具有很好的预防以及治疗作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于开发一种罗非鱼加工副产物——罗非鱼皮再加工工艺，制备具有抗氧化活性的罗非鱼皮明胶肽，提高罗非鱼加工过程中副产物的利用率，避免资源浪费，提高行业额外利润。

为达到上述目的，本发明提供了一种具有抗氧化活性的罗非鱼皮明胶肽的制备方法，包括如下步骤：

s1、取罗非鱼皮清洗，除杂，切碎，加入naoh溶液搅拌浸泡16～32h，浸泡期间每8h换一次溶液，水洗至ph＝7；所述naoh溶液浓度为0.1～0.2mol/l，所述罗非鱼皮与所述naoh溶液的质量体积比为1g：5～10ml；

碱洗的目的是使原料中的胶原蛋白溶解，同时皂化脂肪、溶解并除去原材料中的可溶性杂蛋白，使溶解的非胶原物质在清洗时随废液除去。

s2、向步骤s1所述洗至中性后的鱼皮中加入洗洁精水搅拌浸泡8～24h，浸泡期间每8h换一次溶液，水洗；所述洗洁精水的体积浓度为0.1～2％，所述罗非鱼皮与所述洗洁精水的质量体积比为1g：5～10ml；

加入洗洁精水搅拌浸泡可以进一步去除鱼皮所含的脂肪。

s3、向步骤s2所收集的鱼皮中加入0.1～0.5mol/ml醋酸溶液浸提18～24h后，用200目尼龙纱布双层滤布过滤，过滤所得沉淀水洗至ph＝7；所述罗非鱼皮与所述醋酸溶液质量体积比为1g：10～20ml；

醋酸溶液浸提可以使原料充分酸化膨胀。

s4、将步骤s3所述ph＝7的沉淀复溶于水，45℃浸胀8～12h后，用whatmanno.4滤纸过滤，收集滤液冻干后即得罗非鱼皮明胶；

s5、将步骤s4所述罗非鱼皮明胶采用蛋白酶酶解后，于80～100℃加热5～10min变性处理，制得罗非鱼皮明胶酶解液，冷却至室温后3000～5000×g离心10～30min，收集上清，冻干即得罗非鱼皮明胶肽。

优选方式下，步骤s1所述naoh溶液搅拌浸泡时间为24h，所述naoh溶液浓度为0.1mol/l，所述罗非鱼皮与所述naoh溶液的质量体积比为1g：10ml。

优选方式下，步骤s2所述洗洁精水搅拌浸泡时间为24h，所述洗洁精水浓度为0.1～2％，所述罗非鱼皮与所述洗洁精水的质量体积比为1g：8ml。

优选方式下，步骤s3所述醋酸溶液浸提时间为24h，所述醋酸溶液浓度为0.2mol/l，所述罗非鱼皮与所述醋酸溶液质量体积比为1g：20ml。

优选方式下，步骤s4所述水与沉淀的体积质量比为5ml：1g；

步骤s4所述液态罗非鱼皮明胶经-80℃冷冻1～3h后采用真空冷冻干燥技术干燥24～36h，冻干分3个阶段进行，分别为预冻阶段温度为-50℃、冷冻时间为1h；干燥阶段温度为-50～20℃、冷冻时间为20～30h及恒温阶段温度为20℃、冷冻时间为3～5h，预冻阶段结束后抽真空，真空度设定为1～10pa。

优选方式下，步骤s5所述冻干为真空冷冻干燥，100℃加热10min变性处理。

优选方式下，步骤s5所述酶解反应的具体操作为：

s51、采用凯式定氮法测定步骤s4制得的罗非鱼皮明胶中的蛋白质含量；

s52、以水为溶剂，称取步骤s4制得的罗非鱼皮明胶制备底物浓度(以蛋白质计)为2g/100ml的罗非鱼皮明胶水溶液；

s53、向步骤s52制得的罗非鱼皮明胶水溶液中加入步骤s5所述蛋白酶，调节ph至6.0～8.5，37～55℃酶解0.5～3h；所述商品化的蛋白酶浓度为2000～3000(u/g底物蛋白)。

进一步优化，步骤s5所述蛋白酶包括：风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶；具体酶解条件如下，风味蛋白酶：50℃、ph＝7.0；中性蛋白酶：50℃、ph＝7.0；碱性蛋白酶：50℃、ph＝8.5；胰蛋白酶：37℃、ph＝8.0；木瓜蛋白酶：55℃、ph＝6.0。

本发明的技术创新在于：

1、与一般的有机溶剂除脂工艺的高成本、易污染环境且有害人体相比，本发明中原料除脂工艺采用家庭用洗洁精来去除鱼皮中存在的脂肪，且使用浓度较低，安全无污染的同时大大降低了生产成本。

2、本发明方法涉及的操作过程简单，无需复杂的设备，所获得的抗氧化制品其清除羟基自由基活性(esr)最高ic50值为11±0.22mg/ml、清除dpph自由基活性最高ic50值为16±0.75mg/ml，说明以罗非鱼皮为原料制备罗非鱼皮明胶肽是一种有效且实用的罗非鱼皮抗氧化制品的制备方法，适合工业化生产。

3、将鱼皮作为原料制备成明胶肽类产品不仅使得罗非鱼加工副产物变废为宝、促进自然资源合理应用，同时也提高了行业的额外利润，具有重要的社会和经济价值。

附图说明

图1为罗非鱼皮明胶水解度变化曲线。

图2为罗非鱼皮明胶水解过程中tca可溶性寡肽变化曲线。

图3为罗非鱼皮明胶肽羟基自由基清除活性(esr)。

图4为罗非鱼皮明胶肽dpph自由基清除活性。

图5为罗非鱼皮明胶肽abts自由基清除活性。

具体实施方式

实施例1

s1、取新鲜罗非鱼皮，去除鱼皮表面鳞片及杂质，用去离子水冲洗干净并将其切碎；

s2、向步骤s1所述切碎后的鱼皮中加入浓度为0.1mol/l氢氧化钠溶液(鱼皮质量与溶液体积比为1g：10ml)搅拌浸泡24h；

s3、步骤s2所得碱洗鱼皮去离子水洗至ph为7；

s4、步骤s3所得ph7的鱼皮中加入浓度为0.1～2％的洗洁精水(鱼皮质量与洗洁精体积比为1g：8ml)并搅拌浸泡24h；

s5、将步骤s4中所得鱼皮用去离子水清洗干净；

s6、步骤s5中洗净鱼皮中加入浓度为0.2mol/l醋酸溶液(鱼皮质量与醋酸溶液体积比为1g：20ml)浸提24h后滤布过滤，所得沉淀用去离子水洗至ph7；

s7、步骤s6中ph7的鱼皮加去离子水(沉淀质量与去离子水体积比为1g：5ml)于45℃恒温水浴浸胀8～12h；

s8、步骤s7中水浴浸胀后混合物采用whatmanno.4滤纸过滤，收集滤液真空冷冻干燥后即得罗非鱼皮明胶；

s9、将s8所得罗非鱼皮明胶加去离子水配成底物浓度(以蛋白质计)2g/100ml后100℃水浴中加热10min进行变性处理，冷却后分别以风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶为工具酶，酶加量3000u/g蛋白、对罗非鱼皮明胶进行酶解处理(每种酶的酶解ph及温度如表1所示)；酶解时间分别为0.5h，1h，1.5h、2h，3h。酶解后100℃水浴灭酶10min，于4000×g下离心10min，取上清液冷冻干燥得到25种罗非鱼皮明胶肽冻干粉；通过反应过程中水解度及tca可溶性寡肽含量变化综合考量筛选最优酶解条件，得到结果如图1和图2所示，经五种蛋白酶水解后各原料水解度大小依次为：木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>碱性蛋白酶>中性蛋白酶>风味蛋白酶；tca可溶性寡肽测定结果中，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶及胰蛋白酶均在酶解到60min时tca寡肽含量达到最高，其寡肽含量分别为70.99％、67.11％、56.82％和54.44％，而碱性蛋白酶酶解物在酶解120min时tca寡肽含量达最高，为56.23％。

s10、结合s9所述水解度及tca可溶性寡肽得率变化曲线，水解度及tca可溶性寡肽得率均较高时表明此时原料酶解效果较好，综合比较选取5种酶分别酶解1h和2h制备10种罗非鱼皮明胶肽原料。确定最优酶解条件：五种酶于最适酶反应条件(表1)下分别酶解1h和2h。

表1

实施例2

s1、取新鲜罗非鱼皮，去除鱼皮表面鳞片及杂质，用去离子水冲洗干净并将其切碎；

s2、向步骤s1所述切碎后的鱼皮中加入浓度为0.1mol/l氢氧化钠溶液(鱼皮质量与溶液体积比为1g：10ml)搅拌浸泡24h；

s3、步骤s2所得碱洗鱼皮去离子水洗至ph7；

s4、步骤s3所得ph7的鱼皮中加入浓度为0.1～2％的洗洁精水(鱼皮质量与洗洁精体积比为1g：8ml)并搅拌浸泡24h；

s5、将步骤s4中所得鱼皮用去离子水清洗干净；

s6、步骤s5中洗净鱼皮中加入浓度为0.2mol/l醋酸溶液(鱼皮质量与醋酸溶液体积比为1g：20ml)浸提24h后滤布过滤，所得沉淀用去离子水洗至ph7；

s7、步骤s6中ph7的鱼皮加去离子水(沉淀质量与去离子水体积比为1g：5ml)于45℃恒温水浴浸胀8～12h；

s8、步骤s7中水浴浸胀后混合物采用whatmanno.4滤纸过滤，收集滤液真空冷冻干燥后即得罗非鱼皮明胶；

s9、将s8所得罗非鱼皮明胶加去离子水配成底物浓度(以蛋白质计)2g/100ml后100℃水浴中加热10min进行变性处理，冷却后在最优方式下进行酶解，分别以风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶为工具酶，酶加量3000u/g蛋白、对罗非鱼皮明胶进行酶解处理(每种酶的酶解ph及温度如表1所示)，酶解时间分别为1h和2h。酶解后100℃水浴灭酶10min，于4000×g下离心10min，取上清液冷冻干燥得到10种罗非鱼皮明胶肽冻干粉。

s10、将s9中10种罗非鱼皮明胶肽利用化学法测定其羟基(esr)、dpph及abts自由基清除活性进一步筛选出抗氧化活性较高样品；

半抑制率(ic50)是表征物质抗氧化能力的常用指标，该指标反映了抗氧化物质提供50％抑制作用时的浓度。以羟基自由基半抑制率(ic50)的计算方法为例：首先测定不同浓度罗非鱼皮明胶酶解物对羟基自由基的清除能力，以样品浓度(mg/ml)为横坐标，羟基清除率(％)为纵坐标，采用excel软件做散点图，并作回归方程分析。通过回归方程，计算出羟基清除率为50％时，罗非鱼皮明胶酶解物的浓度，即为羟基自由基半抑制率(ic50值)。

各项抗氧化活性测定结果均以半抑制率(ic50)为指标，该数值越低说明抗氧化能力越强。综合比较，酶解1h的样品抗氧化活性高于2h样品。确定5种酶酶解所得罗非鱼皮明胶肽最优酶解时间为1h。不同条件下罗非鱼皮明胶肽的抗氧化能力对比结果见图3、图4和图5，总体上可以看出样品羟基自由基清除活性最好，其次为dpph自由基清除活性，abts自由基清除能力最低。

图3和图4中羟基自由基及dpph自由基清除活性实验结果可以得出木瓜蛋白酶酶解1h样品抗氧化活性最强，羟基自由基清除活性ic50值为12±1.43mg/ml，与谷胱甘肽(gsh)相比仅差一个数量级，其dpph自由基清除活性ic50值为16±0.75mg/ml；其次为碱性蛋白酶酶解1h样品，其羟基自由基清除活性ic50值为11±0.22mg/ml，与谷胱甘肽(gsh)相比仅差一个数量级，dpph自由基清除活性ic50值为33±0.02mg/ml。

图5中样品abts自由基清除活性测定结果表明同种酶不同酶解时间条件下，abts自由基清除活性作用并不明显；但是可以看出不同种酶作用条件下，碱性和木瓜两种蛋白酶酶解后样品abts自由基清除活性活性较强。

结合图3～5结论综合比较最终确定最优方式下，抗氧化活性较强的两种罗非鱼皮明胶肽为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分别酶解1h条件下所制得的样品。

采用电子顺磁共振波谱仪法(esr)测定样品羟基自由基清除活性，仪器灵敏度高，直接测定不破坏样品，测定结果准确可靠。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。