一种光学分子成像报告基因及其用途的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明公开了一种光学分子成像报告基因及其用途。
背景技术：
：肿瘤转移是恶性肿瘤的主要特征之一，是导致恶性肿瘤患者死亡的首要因素。虽然现阶段对恶性肿瘤的检测与治疗均有了长足进步，但肿瘤转移对患者来说无疑是一场致命的灾难。而近年来研究表明，上皮间质转化(epthelial-mesenchymaltransition，以下简称emt)是恶性肿瘤发生侵袭和远处转移的关键步骤。emt是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过emt，上皮细胞失去了细胞极性，也失去了与基底膜连接等上皮表型，同时获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。因而，阐明调控恶性肿瘤细胞发生emt的分子机制，明确emt在恶性肿瘤发生、发展和转移过程中的意义，并探索基于emt关键分子的诊断方法及靶向emt关键分子的治疗手段，均是肿瘤转移中emt机制研究的关键科学问题。同时，建立恶性肿瘤转移早期预警平台，构建在活体监测和评价恶性肿瘤早期浸润及转移的报告系统，对早期发现恶性肿瘤转移、研发针对恶性肿瘤转移的分子靶向药物具有重要意义。然而，传统研究体内肿瘤的方法主要依靠病理学诊断，需屠杀大量动物，且不能反复检测，限制了在同一个动物体内连续观察细胞增殖动态变化，更无法获得在同一动物检测的时空信息。光学分子影像技术在监测体内特定的分子或者分子路径方面具有实时、敏感性高等优势。分子影像技术可在分子和细胞水平上实现生物体生理、病理变化的无创、在体成像，突破了传统影像技术只能检测大体解剖结构变化的局限，改变了传统离体方法不能在体动态连续观测的局面。可以实现在体检测药物治疗效果、能够实时、动态地监测疾病发生发展、药物作用效果及动力学变化，为特定基因功能的研究提供信息获取和分析处理的有效手段。近期，zhong等构建了ihpv-luc报告体系用于监测hpv阳性的口腔肿瘤的增殖和放疗疗效，结果显示该生物发光成像体系可以直观、快速地反映hpv阳性肿瘤的增殖情况，并可指导临床用药以及新药筛选、放疗方案设计等。如前所述，肿瘤转移是一个复杂的分子事件，涉及一系列的生物学过程，而emt是肿瘤转移发生的重要过程，以抑制肿瘤细胞emt为靶点的治疗方案是治疗转移性癌或抑制肿瘤转移的潜在策略。在emt过程中，上皮细胞从高度分化的极性细胞转化为未分化的间质表型的细胞，但该过程是暂时的。当间质表型的细胞到达远处部位时，需要先经过间质上皮转化(mesenchymal-epithelialtransition，met)的过程，再次转化为上皮表型，才会在继发部位种植并增长，形成继发肿瘤。因此，如果能够在体成像恶性肿瘤的emt过程的变化，可以提前预警恶性肿瘤细胞的转移过程，并为相应患者提供个体化的治疗方案，为相应的药物筛选提供高通量的平台。现阶段研究表明，mirna是调控细胞分化的重要分子，同时也参与了与发育和肿瘤的emt过程。既往研究证实，mirna-200家族可以诱导细胞分化，通过抑制emt活化分子zeb1/2的翻译过程，进而抑制emt过程。然而，mirna是一类小分子rna，长度仅为21～23bp，其通过与下游靶分子mrna的3’非翻译区(3’-untranslatedregion，3’-utr)结合，进而抑制后者的翻译或促进后者的降解，从而抑制下游蛋白的活性。常用检测mirna的方法为northernblot和realtimepcr，虽然这些方法可操作性强，但存在侵袭性，需要将组织或细胞取出并裂解后提取总mirna后进行检测，不能进行活体连续观察。技术实现要素：本发明的发明人以mir-200c为靶点构建能够在体监测恶性肿瘤emt过程的光学分子成像报告基因系统，即利用光学成像技术，实现在分子水平监测mir-200c的改变及相关分子或药物对该通路的调控作用，通过光学分子成像技术监测mir-200c信号通路反映恶性肿瘤emt过程及其在恶性肿瘤转移过程中的作用。为理解恶性肿瘤emt复杂的信号网络提供新的视角，揭示恶性肿瘤emt复杂的分子生物学机理；也可为活体内实时分子显像及emt的预测提供更全面的分子成像技术和诊断探针。通过该方法，将能够全面地在体监测mir-200c信号通路及其活性，为研究mir-200c在恶性肿瘤发生发展过程中的作用提供有力的技术平台，能够在活体实时监测恶性肿瘤的进展、转移和疗效评价，同时也可为抗肿瘤药物的研发和筛选提供光学成像工具。本发明公开了一种光学分子成像报告基因，为seqidno.1序列整合入pcdna3.1(+)/luc2＝tdt(addgeneplasmid32904)质粒而得。更具体地，本发明公开的光学分子成像报告基因，其物理图谱如图1所示，其中pcdna3.1(+)为质粒骨架，luc2＝tdt为该质粒所表达下游融合蛋白，cmvpro为启动子，xhoi和noti为酶切位点。本发明公开的光学分子成像报告基因的制备方法，包括：a)合成mir-200c的反向互补序列mir-200c_3xts，其序列为seqidno.1,在mir-200c_3xts的两端分别设计加入xbai和noti的酶切位点；b)将mir-200c_3xts嵌入pcdna3.1(+)/luc2＝tdt；c)连接的质粒转化入dh5α后，用含氨苄青霉素的lb培养基筛选目的质粒luc2＝tdt-mir-200c-3ts，挑取单克隆，获得序列正确的目的质粒。本发明还公开了上述光学分子成像报告基因的用途，可以在细胞水平、动物水平实时动态监测乳腺癌细胞中mir-200c表达量的变化，并间接反映乳腺癌细胞emt转化过程，建立以emt为靶点的抗肿瘤药物的高通量筛选平台，并指导临床个体化治疗的用药。本发明公开的光学分子成像报告基因的更具体的制备方法如下：首先，通过查找文献及现有实验数据确定与恶性肿瘤密切相关的mir-200c为研究靶点，该分子可以抑制emt活化分子zeb1/2的作用，抑制emt过程，同时，mir-200c可以抑制恶性肿瘤的干细胞特性，并促进间质表型向上皮细胞分化，因此在恶性肿瘤浸润和转移过程发挥重要的作用；然后在pubmed数据库查找mir-200c序列：5’-uaauacugccggguaaugaugga-3’；根据mir-200c序列设计其反向互补序列(即称为靶序列，targetsequence，ts)，重复3次，增加mir-200c与其结合效率，并在重复序列中间加入相应的保护序列，称为mir-200c_3xts，序列全长为：5’-tccatcattacccggcagtattatagtatccatcattacccggcagtattatagtatccatcattacccggcagtatta-3’；并在mir-200c_3xts的两端分别设计加入xbai和noti的酶切位点；骨架质粒所用为pcdna3.1(+)/luc2＝tdt，addgene质粒，编号plasmid32904，(市售)；该质粒骨架表达融合蛋白的下游3’-utr位置含有xbai和noti的酶切位点；通过限制性内切酶xbai和noti分别酶切目的片段和骨架质粒，获得线状质粒骨架片段和需插入序列片段；连接后，目的质粒中mir-200c的反向互补序列(mir-200c_3xts)位于融合蛋白下游，当mir-200c高表达时将于其mrna结合，从而抑制融合蛋白luc2＝tdt的表达；进而将连接的质粒转化入dh5α，用含氨苄青霉素的lb培养基筛选目的质粒luc2＝tdt-mir-200c-3ts，挑取单克隆，通过质粒小提的方法获得质粒溶液；测定浓度，并通过限制性内切酶酶切和直接测序方法验证构建的质粒序列的正确性。利用本发明公开的光学分子成像报告基因，以乳腺癌为例进行体内外验证，选择mda-mb-231(高侵袭性)和mcf7(低侵袭性)进行转染，并用g418筛选稳定转染的细胞株进行后续实验；试验结果表明：所构建的稳定转染细胞系均能够稳定持续表达本发明公开的光学分子成像报告基因。利用本发明公开的光学分子成像报告基因进行体外实验验证，分别利用mir-200c的抑制剂和模拟物，以及emt诱导分子tgf-β1处理稳定转染细胞株，并检测荧光素酶活性、rt-pcr、westernblot等方法验证所构建的报告基因luc2＝tdt-mir-200c-3ts可以在细胞水平反映mir-200c的表达量，同时间接反映乳腺癌细胞emt的过程；实验结果表明，本发明公开的光学分子成像报告基因质粒能够在体外实验中有效反映乳腺癌细胞中mir-200c的表达量，有进一步应用于体内的潜能。利用本发明公开的光学分子成像报告基因体内实验验证，构建裸鼠在体皮下异位移植瘤模型，利用mir-200c的模拟物进行体内转染，报告基因luc2＝tdt-mir-200c-3ts可以在动物水平反映mir-200c的表达量，同时间接反映乳腺癌细胞emt的过程，以期指导抗肿瘤药物的筛选和临床用药。附图说明图1：光学分子成像报告基因物理图谱；图2：逆转录检测不同乳腺癌细胞株中mir-200c的表达量；图3：逆转录检测乳腺癌细胞株中mir-200c的表达量的变化对emt相关分子指标的调控影响；图4：报告基因luc2＝tdt-mir-200c-3ts模式图；图5：限制性内切酶酶切鉴定所合成报告基因质粒的正确性；图6：直接测序法鉴定所合成报告基因质粒的正确性；图7：利用westernblot实验在蛋白水平检测mir-200c对emt相关分子表达量的影响试验；图8：划痕实验；图9：光学分子成像报告基因检测乳腺癌细胞内源性mir-200c的表达量；图10：光学分子成像报告基因检测外源性mir-200c的表达量；图11：transwell细胞小室实验检测mir-200c表达量对细胞迁移和转移能力的影响；图12：上皮间质转化相关因子tgf-β1诱导荧光素酶活性增加；图13：于iviskinetics下检测mir-200c表达量对荧光素酶活性的影响；图14：于iviskinetics下检测上皮间质转化相关因子tgf-β1处理对荧光素酶活性的影响；图15：活体内监测体循环mir-200c的表达量对荧光素酶活性的影响；图16：活体内监测瘤周mir-200c的表达量对荧光素酶活性的影响；图17：利免疫组织化学染色方法。具体实施方式以下实施例、试验例仅仅是对本发明的进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。实施例中所用的质粒、细胞株、试剂盒等如果没有标注来源，均为市售。实施例1：光学分子成像报告基因的luc2＝tdt-mir-200c-3ts物理图谱及其构建a)通过查找文献及现有实验数据确定与恶性肿瘤密切相关的mir-200c为研究靶点，该分子可以抑制emt活化分子zeb1/2的作用，抑制emt过程，同时，mir-200c可以抑制恶性肿瘤的干细胞特性，并促进间质表型向上皮细胞分化，因此在恶性肿瘤浸润和转移过程发挥重要的作用；b)在pubmed数据库查找mir-200c序列：5’-uaauacugccggguaaugaugga-3’；c)根据mir-200c序列设计其反向互补序列(即称为靶序列，targetsequence，ts)，重复3次，增加mir-200c与其结合效率，并在重复序列中间加入相应的保护序列，称为mir-200c_3xts，序列全长为5’-tccatcattacccggcagtattatagtatccatcattacccggcagtattatagtatccatcattacccggcagtatta-3’，即图1中箭头所示序列为seqidno.1序列；d)在mir-200c_3xts的两端分别设计加入xbai和noti的酶切位点，由于该部分碱基序列较短，由takara公司直接合成；e)骨架质粒所用为pcdna3.1(+)/luc2＝tdt，addgene质粒，编号plasmid32904，(市售)；该质粒骨架表达融合蛋白的下游3’-utr位置含有xbai和noti的酶切位点；●取ep管，分别加样如下：●将上述溶液置于37℃孵育4小时；●琼脂糖凝胶电泳检测：取5微升样品和5微升dna上样缓冲液混匀上样，150伏恒压电泳20-30分钟，同时取200纳克左右没有酶切的质粒做对照；f)通过上述步骤分别获得线状质粒骨架片段和需插入序列片段●取ep管，加样如下：●将上述溶液置于4℃水浴过夜；g)连接后，目的质粒luc2＝tdt-mir-200c-3ts中mir-200c的反向互补序列(mir-200c_3xts)位于融合蛋白下游，当mir-200c高表达时将于其mrna结合，从而抑制融合蛋白luc2＝tdt的表达；h)将连接的质粒转化入dh5α，具体步骤如下：●冰上融化感受态细胞dh5α(takara公司，编号d905)；●取100微升dh5α至灭菌处理的试管中；●加入上述连接的质粒，冰中放置30分钟；●42℃水浴中热击45秒后，冰中放置3分钟；●取适量涂布含氨苄青霉素的lb平板培养基，置于37℃过夜培养；i)用含氨苄青霉素的lb培养基筛选目的质粒luc2＝tdt-mir-200c-3ts，挑取单克隆，获得序列正确的目的质粒；j)光学分子成像报告基因的luc2＝tdt-mir-200c-3ts物理图谱详见图1，其中pcdna3.1(+)/luc2＝tdt为原始质粒骨架，全长8572个碱基对，cmvpro为启动子，luc2＝tdtrfp为该质粒所表达的下游融合蛋白，neor表示该质粒具有新霉素抗性，xbai和noti为质粒上相应的限制性内切酶酶切位点，箭头所示序列为seqidno.1序列，即mir-200c_3xts。实施例2：逆转录检测不同乳腺癌细胞株中mir-200c的表达量a)取100毫米培养皿的乳腺癌细胞mda-mb-231，bt549，mcf7，mda-mb-468，mda-mb-453和t47d各一板，细胞汇合度90％；b)提取总rna；●用磷酸盐缓冲液(pbs)5毫升洗1次；●加入rnaisoplus(9108,takara,tokyo,japan)各1毫升/板；水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液器吹打细胞使其脱落；●将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液器反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀；并室温静置5分钟；●向上述匀浆裂解液中加入氯仿(rnaisoplus的1/5的体积量)，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15秒，待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5分钟；●4℃温度下12,000转/分钟，离心15分钟；●从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中；●向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟；●4℃温度下12,000转/分钟，离心10分钟，一般在离心后，试管底部会出现沉淀；●小心弃去上清液，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1毫升，切勿触及沉淀，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，4℃温度下12,000转/分钟，离心5分钟后小心弃去乙醇；●室温干燥沉淀2～5分钟，加入适量的rnase-free水溶解沉淀后待用；c)用nanodrop分光光度计(nanodropnd-2000cuv-visspectrophotometer，nanodroptechnologies，rockland，de，usa)测定rna样本浓度；d)逆转录总microrna：使用onestepmirnacdnasynthesiskit(d350a,takara)试剂盒反转录总microrna；●配制mastermix并分装至rnase-free的0.2毫升的ep管中，各主要成分如下表：●将ep管置于pcr仪9700中，反应条件如下：●向得到的rt反应液(即逆转录的cdna)中添加rnasefreedh2o补足至100微升；e)real-timepcr反应检测mir-200c的表达量：使用takara公司的premixextaqtmii试剂盒；●配制mastermix并分装至rnase-free的0.2毫升的八联管中，各主要成分如下表：●在八联管各孔中，分别加入需做pcr反应的逆转录的cdna2微升，并将各八联管置于离心机中瞬离，使液体混匀并下移至管底；●将ep管置于pcr仪7300中，反应条件如下：f)上述反应结束后确认real-timepcr的扩增曲线和融解曲线，并根据实验设计分析各组目的mirna的表达情况的差异；g)用graphpad软件绘图分析，结果见图2，结果表明，mir-200c在侵袭性高的三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231和bt549中表达较高。实施例3：逆转录检测乳腺癌细胞株中mir-200c的表达量的变化对emt相关分子指标的调控影响a)转染mir-200c的模拟物或抑制剂：使用lipofectamine2000(invitrogen)转染试剂；●取60毫米培养皿的乳腺癌细胞mda-mb-231和mcf7各2板，细胞汇合度70％；●取ep管，加样如下(微升)：●按上述剂量加样后，室温静置5分钟；a+b，c+d分别混合，室温静置15分钟；●将上述混合溶液a+b，c+d分别加入2板mda-mb-231(模拟物)或mcf7(抑制剂)中，轻摇，置于二氧化碳培养箱中继续培养；b)24小时后，用实施例2步骤b)和c)的方法裂解并提取细胞株中总rna并定量；c)逆转录总mirna：用实施例2步骤d)的方法逆转录总mirna；d)逆转录总mrna：用rtreagentkit(drr037a,takara)试剂盒反转录总mrna●冰上配制逆转录反应液：●将ep管置于pcr仪9700中，反应条件如下：●向得到的rt反应液(即逆转录的cdna)中添加rnasefreedh2o补足至50微升；e)real-timepcr反应检测mir-200c的表达量及emt相关分子的表达量：用实施例2步骤e)的方法进行real-timepcr反应；f)上述反应结束后确认real-timepcr的扩增曲线和融解曲线，并根据实验设计分析各组目的mirna和mrna的表达情况的差异；g)用graphpad软件绘图分析，结果见图3，结果表明，转染mir-200c模拟物后，mir-200c上升，上皮表型分子表达增加，间质表型分子表达减少；转染mir-200c抑制剂后，结果相反。实施例4：报告基因luc2＝tdt-mir-200c-3ts模式图参考实施例1，其中cmvpromoter为该质粒的启动子，luc2＝tdt为该质粒所表达的下游融合蛋白，targetsequence即实施例1中的seqidno.1序列，即mir-200c_3xts，右侧爆炸星的大小代表光子量的多少。结果见图4，结果表明：当mir-200c低表达时，荧光素酶的活性较高，光子数较多；当mir-200c表达增加时，荧光素酶的活性受到抑制，光子数减少。实施例5：限制性内切酶酶切鉴定所合成报告基因质粒的正确性a)取等量合成报告基因质粒分为四组，加样如下(微升)b)将上述溶液置于37℃温箱中孵育1小时；c)取上述四组溶液10微升加样于琼脂糖凝胶中，并于80伏电压下水平电泳；d)将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外光线下，观察条带，见图5，可以看到a组形成单一条带，b和c组单酶切组也形成单一条带，且条带大小略低于a组，而双酶切d组形成两条条带，与预期符合。实施例6：直接测序法鉴定所合成报告基因质粒的正确性a)取合成报告基因质粒送测序公司测序；b)比对后，图6所示，结果序列与预期完全一致。实施例7：利用westernblot实验在蛋白水平检测mir-200c对emt相关分子表达量的影响a)取mda-mb-231和mcf7，并在此基础上构建稳定表达合成报告基因质粒的细胞系，步骤如下：●取60毫米培养皿的mda-mb-231和mcf7各2板，汇合度达90％；●取4支ep管，加样分组如下：●按上述剂量加样后，室温静置5分钟；a+b，c+d分别混合，室温静置15分钟；●将上述混合溶液a+b，c+d分别加入2板mda-mb-231或mcf7中，轻摇，置于二氧化碳培养箱中继续培养；●24小时后，传代至100毫米培养皿中继续培养；●48小时后，加g4181000微克/毫升筛选，并选取一板未转染的空白细胞作为对照；●待空白对照细胞全部死亡后，建立稳定表达合成报告基因质粒luc2＝tdt-mir-200c-3ts及对照质粒pcdna3.1(+)/luc2＝tdt的细胞系mda-mb-231和mcf7，分别标注为m231-reporter(报告基因)，m231-control(对照)，mcf7-reporter(报告基因)，mcf7-control(对照)；b)利用实施例3步骤a)的方法分别在m231-reporter和mcf7-reporter细胞中转染mir-200c的模拟物和抑制剂；c)提取总蛋白：利用e1910(promega公司)试剂盒中的被动裂解液(plb)裂解细胞提取总蛋白；●24小时后，小心弃去细胞培养基，用pbl洗2次；●60毫米培养皿中加入400微升被动裂解液(1xplb)，冰上裂解细胞；●将培养皿置入-80℃冰箱中冻融一次；●取出后冰上融解，用细胞刮轻轻刮离细胞，用移液器转移至1.5毫升的ep管中，冰上放置10分钟；●用涡旋振荡器振荡15秒后，室温下12,000转/分钟，离心15秒，吸取上清液并转移到新的ep管中，切勿触及沉淀；●上述上清即为裂解所得的总蛋白溶液；d)检测蛋白浓度：利用bca蛋白浓度测定试剂盒(p0012，碧云天公司)检测蛋白浓度；●配制bca工作液：根据需测蛋白样品的数量配制，a液:b液＝50:1，充分混匀；●冰上溶解蛋白标准品bsa(5毫克/毫升)，取10微升用ddh2o以10倍稀释，终浓度为0.5毫克/毫升；●绘制标准曲线：取96孔板，将标准蛋白依次加入0微升、1微升、2微升、4微升、8微升、12微升、16微升、20微升，用1xpbs将标准蛋白孔液体补足至20微升；●待测蛋白样品用1xpbs以1:10稀释，每孔加20微升稀释液，每个样品重复2次；●每孔加入200微升配制好的bca工作液，置于37℃温箱中孵育30分钟；●取出96孔板，置于elx800tm全自动酶标仪中，于570纳米波长下进行检测；●根据标准曲线计算出蛋白样品的浓度。e)利用westernblot实验，分别检测luc2＝tdt及emt相关蛋白的表达情况；●分别取50μg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子量marker，按4:1体积比加入5x样品缓冲液，以1x样品缓冲液配平上样体积后，于沸水浴中煮3分钟使蛋白变性；●将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中；●接通电源，初始电压70伏，待溴酚蓝然染料进入分离胶后提高电压，电泳至溴酚蓝至分离胶的下缘；●取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95％乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用；●按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡；●将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90伏稳压转移2小时；●把硝酸纤维素膜浸入5％脱脂奶粉，室温摇动2小时；●第一抗体封闭，4℃振摇过夜；●t-tbs洗膜，10分钟x3次；●第二抗体封闭，室温振摇60分钟；●t-tbs洗膜，10分钟x3次；●将化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5毫升，按1：1的比例混合，在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1分钟；●用滤纸沾干膜上的液体，用保鲜膜包好，用感光胶片在压片盒中曝光；●曝光后的感光胶片在显影液中显影约30秒钟，定影液中定影1分钟，用水冲洗后晾干；f)结果图7所示，结果表明转染mir-200c模拟物后，mir-200c上升，导致下游蛋白luc2＝tdt表达减少，而上皮表型分子表达增加，间质表型分子表达减少；转染mir-200c抑制剂后，结果相反。实施例8：划痕实验a)取六孔板培养细胞mda-mb-231或mcf7细胞，依实施例3步骤a)分别转染mir-200c的模拟物或抑制剂及其对应的阴性对照(nc)；b)24小时后，用200微升枪头于底部细胞层划一条直线(即划痕)，并分别于0小时、12小时、24小时在显微镜下照相，对比不同组中细胞的迁移能力；c)结果见图8，结果表明，转染mir-200c模拟物后，划痕修复能力明显减弱；而转染mir-200c抑制剂后，划痕修复能力增强。实施例9：光学分子成像报告基因检测乳腺癌细胞内源性mir-200c的表达量a)取mda-mb-231和mcf7细胞，瞬时转染光学分子成像报告基因及其对照质粒，步骤如下：●取60毫米培养皿的mda-mb-231和mcf7各2板，汇合度达90％；●取4支ep管，加样分组如下：●按上述剂量加样后，室温静置5分钟；a+b，c+d分别混合，室温静置15分钟；●将上述混合溶液a+b，c+d分别加入2板mda-mb-231或mcf7中，轻摇，置于二氧化碳培养箱中继续培养；b)24小时后，依实施例7步骤c)和d)的方法提取总蛋白并测定蛋白浓度；c)检测双荧光素酶活性：使用e1910双荧光素酶报告基因检测试剂盒(promega公司)；●在检测管中加入100微升larii(e1910)；取上述细胞裂解液20微升加入检测管中，置于lb9507(berthold，德国)中读值，即fluc(萤火虫荧光素酶)的活性；●于检测管中加入100微升stop&reagent(e1910)，再次置于lb9507(berthold，德国)中读值，即rluc(海肾荧光素酶)的活性；●计算两者比值，即ratio＝fluc/rluc；d)结果见图9，结果表明在高表达mir-200c的mcf7细胞中荧光素酶的活性明显受到抑制，低于对照组；而低表达mir-200c的mda-mb-231细胞中，两组荧光素酶的活性相差无几；提示合成的报告基因可以反映细胞内源性mir-200c的表达量。实施例10：光学分子成像报告基因检测外源性mir-200c的表达量a)取实施例7步骤a)所构建的稳定表达光学分子成像报告基因及其对照质粒的mda-mb-231和mcf7细胞，即m231-reporter(报告基因)，m231-control(对照)，mcf7-reporter(报告基因)，mcf7-control(对照)各一六孔板；b)依实施例3步骤a)的方法转染不同浓度的mir-200c模拟物或抑制剂，剂量及分组如下表：c)24小时后，依实施例7步骤c)和d)的方法提取总蛋白并测定蛋白浓度；d)检测单荧光素酶活性：使用e4530单荧光素酶报告基因检测试剂盒(promega公司)；●在检测管中加入100微升荧光素酶底物d-luciferin(e4530)；●取上述细胞裂解液20微升加入检测管中，置于lb9507(berthold，德国)中读值，即fluc(萤火虫荧光素酶)的活性；e)用graphpad绘制图片如图10所示，结果显示，在低表达mir-200c的mda-mb-231稳转细胞中，转染不同浓度的模拟物，荧光素酶的活性呈浓度依赖性减少(a)，而在高表达mir-200c的mcf7稳转细胞中，转染不同浓度的抑制剂，荧光素酶的活性呈浓度依赖性增加(b)；提示合成的报告基因可以反映细胞外源性mir-200c的表达量。实施例11：transwell细胞小室实验检测mir-200c表达量对细胞迁移和转移能力的影响a)利用实施例3步骤a)在mda-mb-231和mcf7细胞中分别转染mir-200c的模拟物和抑制剂；b)24小时后更换无血清培养基饥饿12小时；c)12小时后，弃去培养基；d)用pbs洗2次；e)胰酶消化成单细胞悬液后，终止消化；f)用细胞计数板计数；g)用无血清培养基重悬，将细胞置于transwell小室的上层，下层加入含10％胎牛血清的培养基，置于培养箱中培养；h)取出小室，用1％结晶紫染色；水洗后，自然晾干；i)于nikonts100-f倒置显微镜下拍照计数；j)结果见图11，结果显示，在mda-mb-231细胞中高表达mir-200c，乳腺癌细胞的迁移和转移能力明显降低(a)；而在mcf7细胞中敲减mir-200c的表达，乳腺癌细胞的迁移和转移能力明显增加(b)。实施例12：上皮间质转化相关因子tgf-β1诱导荧光素酶活性增加a)取实施例7步骤a)所构建的稳定表达合成报告基因质粒的mcf7细胞，即mcf7-reporter，铺12孔板，每孔加入约1x104细胞量，加tgf-β1(santacruz，sc-4561)处理，设置4组，每组三个复孔(拟于不同时间点处理)，分组如下：nc实验组1实验组2实验组3-1纳克/毫升10纳克/毫升100纳克/毫升b)加药后，将上述12孔板置于培养箱中继续培养；c)分别于加药后第2天，第4天和第6天，依实施例10步骤c)和d)的方法处理不同浓度的处理细胞，并分析结果；d)用graphpad软件绘图，结果见图12，结果显示，上皮间质转化相关因子tgf-β1可以诱导荧光素酶的活性，呈浓度依赖性和时间依赖性。实施例13：于iviskinetics下检测mir-200c表达量对荧光素酶活性的影响(reportergene报告基因：luc2＝tdt-mir-200c-3ts，control对照：pcdna3.1(+)/luc2＝tdt，图14同)；a)取实施例7步骤a)所构建的稳定表达合成报告基因及对照质粒的mda-mb-231细胞，即m231-reporter(报告基因)和m231-control(对照)细胞；b)传代至96孔板中，依实施例3步骤a)的方法转染不同浓度的mir-200c模拟物；c)24小时后，每孔加入1微升荧光素酶底物d-luciferin(15毫克/毫升，perkinelmer)；并将96孔板置于iviskinetics下观察并拍照见图13a；d)用graphpad软件量化结果并绘图见图13b，结果显示，荧光素酶的活性明显较对照组受到抑制。实施例14：于iviskinetics下检测上皮间质转化相关因子tgf-β1处理对荧光素酶活性的影响a)取实施例7步骤a)所构建的稳定表达合成报告基因及对照质粒的mcf7细胞，即mcf7-reporter(报告基因)和mcf7-control(对照)细胞；b)将上述细胞传代至96孔板中，各4组，每组8个复孔；c)分别加入不同浓度的上皮间质转化相关因子tgf-β1，浓度分别为0，1纳克/毫升，10纳克/毫升，100纳克/毫升；d)处理48小时后，每孔加入1微升荧光素酶底物d-luciferin(15毫克/毫升，perkinelmer)；将96孔板置于iviskinetics下观察并拍照见图14a；e)用graphpad量化结果并绘图见图14b，结果显示，荧光素酶的活性较对照组明显增强，呈浓度依赖性变化；而对照组基本无变化。实施例15：活体内监测体循环mir-200c的表达量对荧光素酶活性的影响a)取实施例7步骤a)所构建的稳定表达合成报告基因及对照质粒的mda-mb-231细胞，即m231-reporter(报告基因)和m231-control(对照)细胞；b)依实施例11步骤d)、e)和f)的方法消化并计数；c)用pbs重悬，并于裸鼠下肢背部皮下注射；d)连续观察，待皮下肿瘤形成后，尾静脉注射entransterin-vivotransfectionreagent(engreenbiosystem,auckland,newzealand)与mir-200c模拟物的混合试剂；e)并于注射前和注射后24小时，分别腹部注射10微升/克(裸鼠体重)的荧光素酶底物d-luciferin(15毫克/毫升，perkinelmer)，将裸鼠置于iviskinetics下，并于腹部注射底物10分钟时成像，见图15a；f)用graphpad软件定量绘图分析见图15b，结果显示，荧光素酶的活性随着mir-200c表达增加而减少，对照组未见变化。实施例16：活体内监测瘤周mir-200c的表达量对荧光素酶活性的影响a)取实施例7步骤a)所构建的稳定表达合成报告基因质粒的mda-mb-231细胞，即m231-reporter(报告基因)细胞；b)依实施例11步骤d)、e)和f)的方法消化并计数；c)用pbs重悬，并于裸鼠下肢背部皮下注射；d)连续观察，待皮下肿瘤形成后，瘤周注射entransterin-vivotransfectionreagent(engreenbiosystem,auckland,newzealand)与mir-200c模拟物(agomir)或阴性对照(nc)的混合试剂；e)并于注射前和注射后24小时，分别腹部注射10微升/克(裸鼠体重)的荧光素酶底物d-luciferin(15毫克/毫升，perkinelmer)，将裸鼠置于iviskinetics下，并于腹部注射底物10分钟时成像见图16a；f)用graphpad软件定量绘图分析见图16b，结果显示，荧光素酶的活性较对照组明显减少。实施例17：免疫组织化学染色方法a)取实施例16步骤e)的裸鼠，于实验终点处死，并石蜡包埋肿瘤组织；b)切成4微米厚的组织切片；c)免疫组织化学染色：上述切片组织利用该方法染色，观察emt相关分子的表达变化●将组织切片置于60℃恒温箱中烘烤20分钟；●置于二甲苯中浸泡15分钟/次，共3次；●将切片置于梯度酒精中复水10分钟，即无水乙醇10分钟→无水乙醇10分钟→95％乙醇10分钟→80％乙醇10分钟→70％乙醇10分钟→双蒸水10分钟；●pbs洗3次，每次5分钟；3％h2o2孵育10分钟；pbs洗3次，每次5分钟；●抗原修复：在沸水中加入柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)，盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将组织切片置于金属架子上，缓慢加压，使切片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将杆子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子；●pbs洗3次，每次5分钟；●滴加正常山羊血清封闭液，室温放置1小时；●滴加一抗50微升，同时pbs作为阴性对照，4℃过夜；●pbs洗3次，每次5分钟；●滴加二抗50微升，室温静置1小时；●pbs洗3次，每次5分钟；●dab镜下显色；自来水冲洗10分钟；●苏木素复染3分钟；1％盐酸酒精分化10秒；流水冲洗10分钟；●梯度酒精脱水，即75％乙醇10分钟→85％乙醇10分钟→95％乙醇10分钟→无水乙醇10分钟→无水乙醇10分钟；●二甲苯透明，浸泡15分钟，共2次；●中性树脂封片，镜下拍照；d)结果见图17，结果显示，mir-200c模拟物处理组较阴性对照组间质生物学指标vimentin和zeb1表达增加，而上皮生物学指标e-cadherin表达减少，增殖指标ki-67表达无明显变化。sequencelisting<110>汕头大学医学院附属肿瘤医院<120>一种光学分子成像报告基因及其用途<130>2017<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>rna<213>人工合成<400>1uaauacugccggguaaugaugga23<210>2<211>79<212>dna<213>人工合成<400>2tccatcattacccggcagtattatagtatccatcattacccggcagtattatagtatcca60tcattacccggcagtatta79当前第1页12