本发明涉及农用肥料领域，尤其涉及一种整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂的方法。
背景技术：
早在公元12世纪中叶海藻肥已被西欧等地的人们广泛利用。17世纪法国政府大力推荐在沿海地区用海藻作为土壤肥料。1880年有学者第一次报道了施用海藻提取物的对比试验结果，清楚地说明了海藻作为肥料的优越性。大量应用效果和研究表明，海藻提取物应用于作物生产具有很多优点：可提高种子发芽率，促进幼苗生长，提高产量和品质，增加作物抗逆性以及促进作物收获后土壤腐殖质的形成。这些突出的肥效依赖于海藻中天然含有的丰富的植物生长调节剂如细胞激动素、植物生长素、赤霉素、脱落酸、乙烯、甜菜碱、多胺等，除此之外，海藻中还含有海洋生物所特有的海藻多糖、藻朊酸、高度不饱和脂肪酸和陆生植物稀有的锌、溴、碘等矿物元素，以及大量的非含氮有机物和一定数量的氨基酸、蛋白质及微量营养元素外。从上世纪90年代左右，国外海藻肥涌入国内市场并带动了中国本土海藻在农业上的应用和发展，海藻肥在农业上的突出效果和作用一直被农业人士所认可。特别是2014年农业部提出《到2020年化肥施用量零增长行动计划》，环保高效的海藻肥作为新型肥料的一种越来越被行业所青睐和接受。
海藻肥生产中，需要通过细胞破碎或增溶技术提取海藻细胞内含物，同时使大分子物质降解为可溶且易被吸收的小分子物质。常见方法有物理法如机械破碎、低温爆破等，该方法环保，能最大程度保留海藻中的活性成分，但对设备要求高；化学方法如酸碱提取法是目前生产海藻酸的主要方法，但对海藻中的活性成分有一定破坏作用，高温高压强酸强碱工艺过程中控制不当极易出现有机物的碳化现象；生物技术如微生物发酵、酶解法等，可以在保留海藻活性成分的同时，将其大分子转化为能被作物直接吸收的小分子，如微生物直接发酵，还能生产其他海藻原料中不合有的对作物有益的活性成分，但技术要求高，生产周期长，产品稳定性难控制；酶解法是最高效和温和的方法，通过专一性酶制剂降解大分子物质，破坏细胞释放细胞内含物，温和的条件可最大程度的保留海藻本身的活性物质。然而现有酶解技术工艺流程中，原材料海藻都需要经过复杂的前处理过程，获得海藻的细微颗粒以利于酶解的进行。这些前处理包括海藻的浸泡、清洗、除杂、剪切、研磨等，海藻中大量的活性物质如甘露醇、碘、岩藻聚糖及其他在这些前处理工艺中流失，造成最终产品的活性降低。
因此，市场上需要一种生物酶解法处理整体海藻制备海藻植物生长调节剂的方法。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明旨在提供一种利用商品复合酶对海藻进行酶解，克服以往技术中酶解工艺前处理如海藻浸泡、清洗、除杂、剪切、研磨等的复杂性以及这些前处理带来的活性物质流失的弊端，直接对鲜海藻或干海藻整体进行温和高效的软化并酶解，最大程度地保留了海藻中的活性物质，保证了海藻肥的效果和品质的生物酶解法处理整体海藻制备海藻植物生长调节剂的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂的方法，包括以下步骤：
1)生产前准备
①准备原材料：准备完整的鲜海藻或干海藻、纤维素酶、褐藻多糖酶、蛋白酶、果胶酶、淀粉酶；
②准备设备及工装：准备设置有温控装置的酶解罐、胶体磨或均质机、超声振荡设备、卧式螺旋卸料沉降离心机；
③准备工艺辅材：单羟乙基胺、5％质量分数的氢氧化钾、一氯三嗪-β-环糊精；
2)原料的预处理：
若为鲜海藻则将新鲜海藻整体浸泡于1-2倍重量的水中装入酶解罐，其中水中含有鲜海藻重量0.3％-0.8％的无机盐并混合均匀，在温度40-60℃与间歇性搅拌的条件下对海藻进行软化1-3h，得到一种ph6.5-ph7.5的海藻浆液；
若为干海藻则将干海藻整体浸泡于5-10倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量3％-8％的无机盐并混合均匀，在温度40-60℃与间歇性搅拌的条件下对海藻进行软化1-3h，得到一种ph6.5-ph7.5的海藻浆液。
3)一级酶解
将温度控制在35-50℃，在海藻浆液中加入以海藻干重计1-4％的纤维素酶，0.1-0.3％的褐藻多糖酶，间歇式搅拌，酶解时间6-12h，至酶解液ph5-6时结束一级酶解；
4)酶解液除杂
在一级酶解过程中，待稠厚的海藻浆液粘度显著下降，可自由搅拌后，伴随酶解搅拌状态，将酶解体系在2个酶解罐间多次转换，借助沙石沉降进行酶解体系杂质的去除；
5)酶解液均质
将完成步骤3)和步骤4)，已基本液化的酶解海藻浆液，通过胶体磨或均质机进行进一步细化处理，使未彻底酶解的海藻颗粒细化至100nm-10μm；
6)二级酶解
将步骤5)获得的均质酶解液调节至ph6.5-ph7.5，温度调节至50-60℃，加入海藻干重0.1％-0.3％的蛋白酶，1-3％的果胶酶，0.1％-0.2％的淀粉酶，间歇式搅拌进行二级酶解，酶解时间2-4h；
7)后处理
将步骤6)得到的酶解液通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行固液分离，可获得固形物含量在3-10％的海藻酶法提取液；
8)促生长素的分离纯化
①将单羟乙基胺投入7)获得的海藻酶法提取液中，再将混合后的浓缩液置入超声振荡设备，以300w-350w的功率振荡35min-40min，获得终末浆料；
②将终末浆料静置至水溶液和有机溶液自然分层，分离出有机溶液和水溶液；
③采用一氯三嗪-β-环糊精浸入有机溶液中，以每10s间隔搅拌10s，搅拌速率100r/min-150r/min的搅拌工艺搅拌1.5h-2h，即可吸附出所需植物生长调节剂；
④采用5％质量分数的氢氧化钾对吸附有植物生长调节剂的一氯三嗪-β-环糊精进行净化处理，分离杂质，即获得被吸附的高纯促生长素；
⑤采用去离子水浸泡吸附的高纯植物生长调节剂进行水解离，并在水解离容器外施加强度为330v/m-350v/m的直流电场，35min-40min后取出一氯三嗪-β-环糊精，留于去离子水中的即为分离出的高纯促生长素；
9)肥料终配
①将8)中步骤⑤获得的促生长素与8)中步骤②获得的水溶液分开保存和使用，即获得所需整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂。
与现有技术相比较，由于采用了上述技术方案，本发明具有以下优点：采取的最主要原材料是完整的海藻，因此有效成份保有量高，环境友好，可实现更大程度上的可持续发展和资源的最优化利用；生产过程科学而高效，先添加的纤维素酶和褐藻多糖酶在植物细胞水充盈的环境下快速、彻底地发挥其作用，破坏了植物细胞的细胞壁，释放了植物细胞内的各种物质，后添加的蛋白酶、淀粉酶和果胶酶分别分解或裂解水化了这些物质中各种大分子物质，使所有成份分子量降低、体积减小、活性增高；合理利用水和有机溶剂可分别溶解不同极性物质的特性及水和部分不溶于水的有机溶剂自然分离的特性，分离出水溶物和有机溶物，再利用植物中植物促生长素多溶于单羟乙基胺、其它有机物少溶于单羟乙基胺的特性，实现促生长素的精准提取，采用一氯三嗪-β-环糊精把分子量适配的促生长素与少量杂质吸附出来，进一步净化了提取物，由于促生长素分子量较为均一，与一氯三嗪-β-环糊精结合较好，而杂质多通过氢键与一氯三嗪-β-环糊精简单连接，通过氢氧化钾进行断氢键处理后可以获得最高纯度的促生长素，由于获得的促生长素纯度更高，促进植物生长的效果更为明显。
具体实施方式
实施例1
一种整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂的方法，包括以下步骤：
1)生产前准备
①准备原材料：准备完整的干海藻、纤维素酶、褐藻多糖酶、蛋白酶、果胶酶、淀粉酶；
②准备设备及工装：准备设置有温控装置的酶解罐、胶体磨或均质机、超声振荡设备、卧式螺旋卸料沉降离心机；
③准备工艺辅材：单羟乙基胺、5％质量分数的氢氧化钾、一氯三嗪-β-环糊精；
2)原料的预处理：
将干海藻整体浸泡于10倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量5％的亚硫酸钾并混合均匀，在温度50℃与间歇性搅拌的条件下对海藻进行软化2.5h，得到一种ph约为7的海藻浆液。
3)一级酶解
将温度控制在38℃，在海藻浆液中加入以海藻干重计2％的纤维素酶，o.1％的褐藻多糖酶，间歇式搅拌，酶解时间9h，此时酶解液ph5.5，结束一级酶解；
4)酶解液除杂
在一级酶解过程中，待稠厚的海藻浆液粘度显著下降，可自由搅拌后，伴随酶解搅拌状态，将酶解体系在2个酶解罐间多次转换，借助沙石沉降进行酶解体系杂质的去除；
5)酶解液均质
将完成步骤3)和步骤4)，已基本液化的酶解海藻浆液，通过胶体磨或均质机进行进一步细化处理，使未彻底酶解的海藻颗粒细化至1μm；
6)二级酶解
将步骤5)获得的均质酶解液调节至ph7，温度调节至60℃，加入海藻干重0.1％的蛋白酶，1的果胶酶，0.1％的淀粉酶，间歇式搅拌进行二级酶解，酶解时间2h；
7)后处理
将步骤6)得到的酶解液通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行固液分离，可获得固形物含量在7％的海藻酶法提取液；
8)促生长素的分离纯化
①将单羟乙基胺投入7)获得的海藻酶法提取液中，再将混合后的浓缩液置入超声振荡设备，以350w的功率振荡40min，获得终末浆料；
②将终末浆料静置至水溶液和有机溶液自然分层，分离出有机溶液和水溶液；
③采用一氯三嗪-β-环糊精浸入有机溶液中，以每10s间隔搅拌10s，搅拌速率100r/min的搅拌工艺搅拌1.5h，即可吸附出所需植物生长调节剂；
④采用5％质量分数的氢氧化钾对吸附有植物生长调节剂的一氯三嗪-β-环糊精进行净化处理，分离杂质，即获得被吸附的高纯促生长素；
⑤采用去离子水浸泡吸附的高纯植物生长调节剂进行水解离，并在水解离容器外施加强度为330v/m的直流电场，35min后取出一氯三嗪-β-环糊精，留于去离子水中的即为分离出的高纯促生长素；
9)肥料终配
①将8)中步骤⑤获得的促生长素与8)中步骤②获得的水溶液分开保存和使用，即获得所需整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂。
根据本实施例生产的整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂，田间肥效实验情况为：海藻植物生长调节剂在草莓上的实验效果：
实验地点：山东省青岛市城阳区夏庄
实验时间：2016年2月-2016年4月
实验品种：大棚甜宝草莓
实验设计：采用小区对比法，选择生态环境条件良好、肥水和病虫防治等田间管理一致的地块。
实验设2个处理：(1)实施例1工艺生产获得的海藻植物生长调节剂，两种组份分别用水稀释1000倍，同时正反叶面喷施；(2)清水对照，对照区施用等量的清水。每个处理组3个重复，各小区随机排列。
施肥方式：从第二茬果膨果期开始每隔7天正反叶面喷施一次，共施用4次。
实验效果
海藻植物生长调节剂对草莓果实重量及甜度的影响
表1收获期不同处理组的草莓果实重量和果实甜度
各实验组依据实验方案处理完毕后，在各实验重复组分别随机选取10个草莓进行称重及糖度的测定，取平均值为各小区指标。各重复小区指标再取均值为各处理组指标。从数据中可以看到，施用酶解海藻植物生长调节剂后，草莓的果实大小明显比清水对照组大，平均增重22.18％；草莓的甜度相比清水对照组，增加更大，平均甜度增大35.7％。
实施例2
一种整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂的方法，整体与实施例1一致，差异之处在于：
2)原料的预处理：
将新鲜海藻整体浸泡于2倍重量的水中装入酶解罐，其中水中含有鲜海藻重量0.3％的无机盐并混合均匀，在温度40与间歇性搅拌的条件下对海藻进行软化1h，得到一种ph6.5的海藻浆液；
3)一级酶解
将温度控制在35℃，在海藻浆液中加入以海藻干重计4％的纤维素酶，0.3％的褐藻多糖酶，间歇式搅拌，酶解时间6h，至酶解液ph5时结束一级酶解；
5)酶解液均质
将完成步骤3)和步骤4)，已基本液化的酶解海藻浆液，通过胶体磨或均质机进行进一步细化处理，使未彻底酶解的海藻颗粒细化至100nm；
6)二级酶解
将步骤5)获得的均质酶解液调节至ph6.5，温度调节至50℃，加入海藻干重0.3％的蛋白酶，3％的果胶酶，0.2％的淀粉酶，间歇式搅拌进行二级酶解，酶解时间4h；
7)后处理
将步骤6)得到的酶解液通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行固液分离，可获得固形物含量在10％的海藻酶法提取液；
8)促生长素的分离纯化
①将单羟乙基胺投入7)获得的海藻酶法提取液中，再将混合后的浓缩液置入超声振荡设备，以300w的功率振荡35min，获得终末浆料；
③采用一氯三嗪-β-环糊精浸入有机溶液中，以每10s间隔搅拌10s，搅拌速率150r/min的搅拌工艺搅拌2h，即可吸附出所需植物生长调节剂；
⑤采用去离子水浸泡吸附的高纯植物生长调节剂进行水解离，并在水解离容器外施加强度为350v/m的直流电场，40min后取出一氯三嗪-β-环糊精，留于去离子水中的即为分离出的高纯促生长素；
根据本实施例生产的整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂，田间肥效实验情况为：海藻植物生长调节剂在草莓上的实验效果：草莓的果实大小明显比清水对照组大，平均增重23.97％；草莓的甜度相比清水对照组，增加更大，平均甜度增大40.0％。
实施例3
一种整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂的方法，整体与实施例1一致，差异之处在于：
2)原料的预处理：
将干海藻整体浸泡于5倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量5％的亚硫酸钾并混合均匀，在温度60℃与间歇性搅拌的条件下对海藻进行软化3h，得到一种ph约为7的海藻浆液。
3)一级酶解
将温度控制在50℃，在海藻浆液中加入以海藻干重计1％的纤维素酶，0.3％的褐藻多糖酶，间歇式搅拌，酶解时间6h，此时酶解液ph6.5，结束一级酶解；
5)酶解液均质
将完成步骤3)和步骤4)，已基本液化的酶解海藻浆液，通过胶体磨或均质机进行进一步细化处理，使未彻底酶解的海藻颗粒细化至10μm；
6)二级酶解
将步骤5)获得的均质酶解液调节至ph7.5，温度调节至50℃；
7)后处理
将步骤6)得到的酶解液通过卧式螺旋卸料沉降离心机进行固液分离，可获得固形物含量在3％的海藻酶法提取液；
根据本实施例生产的整体生物酶解法制备海藻植物生长调节剂，田间肥效实验情况为：海藻植物生长调节剂在草莓上的实验效果：草莓的果实大小明显比清水对照组大，平均增重19.56％；草莓的甜度相比清水对照组，增加更大，平均甜度增大33.8％。
综上试验说明，采用鲜海藻获取的海藻植物生长调节剂效果优于干海藻，与同时申报的另一发明相比，说明高纯度的促生长素相较于高活性多杂质的促生长素对植物生长的促进作用更加明显。
对所公开的实施例的上述说明，仅为了使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。