富硒蛹虫草及其栽培方法与应用与流程

本发明涉及蛹虫草栽培技术，具体地说，涉及一种富硒蛹虫草及其栽培方法与应用。

背景技术：

硒(selenium,se)元素是人和动物生命活动中不可缺少的微量元素之一，是生物体内硫氧还原蛋白酶、脱碘酶、谷胱甘肽过氧化酶等多种含硒酶蛋白的必需组分，并且参与人体多种代谢途径。研究发现，当机体缺乏硒元素时，会减弱免疫机制，降低对疾病的抵抗力，出现各种相应的缺乏症状。我国具有丰富硒资源，但硒在自然界分布极不均匀，导致我国三分之二以上地区缺硒。中国营养学会及fao/who/iaea联合专家委员会确定人体摄入量适宜范围为60-250μg/d，安全剂量为400μg/d，中毒剂量为800μg/d。硒过量也会造成人体危害，因此亟待为缺硒人群开发安全高效硒源。自然界中硒主要以有机硒和无机硒两种形式存，现已证实膳食中硒的吸收与其化学状态有关，通常无机态硒的生物活性低于有机硒的生物活性。研究表明无机硒(硒酸盐、亚硒酸盐)毒性较大，作为直接补硒源具有潜在危险；而有机硒(硒代蛋氨酸，硒代胱氨酸，硒甲基硒代胱氨酸，等)毒性较低，并具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等。因此利用生物转化，将无机硒转化为具有高活性的有机硒是目前富硒产品的最安全有效的手段之一。外源添加四价硒、六价硒具有较高的环境风险，同时四价硒、六价硒对生物体的毒性作用较大，生物体很难高效的将其利用并不影响其自身品质。而纳米硒的毒性较低，生物体对其吸收和耐受浓度显著高于四价硒和六价硒，因此纳米硒在生物转化过程中更安全、更高效。

蛹虫草(cordycepsmilitaris)又名北冬虫夏草，在生物分学上属于是子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科，虫草属。蛹虫草是一种药食两用真菌，含有丰富的虫草酸、虫草素、腺苷、氨基酸等活性成分，并具有显著的药理作用，如抗疲劳、抗肿瘤、耐缺氧、增强免疫力、增强性功能等。真菌中硒经过生物转化，大部分以有机硒形态存在于子实体中，从而极易被人体吸收利用，但普通蛹虫草子实体中硒含量偏低，同时普通蛹虫草对硒的耐受和生物转化能力较低，在硒浓度达到其耐受限度就出现菌丝和子实体的生长受到严重抑制，甚至死亡。通过化学合成以及微生物发酵的方法制备纳米硒是一种更为简便、经济、绿色环保获取单质硒的方法。通过筛选耐硒蛹虫草菌株，同时利用纳米硒进行富硒蛹虫草的栽培，有效降低了外源硒的环境风险，同时更高程度提升了蛹虫草子实体中有机硒含量。国内外研究人员对微生物参与的硒的各价态间的转化及有机硒的形成有较明确的认识。利用富硒蛹虫草能够完全将无机硒转化为低毒、高活性的有机硒形式，能够更加安全高效的进行补硒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种富硒蛹虫草及其栽培方法。

本发明的另一目的是提供所述富硒蛹虫草在富硒功能食品、保健品以及饲料产品中的应用。

本发明的又一目的是提供利用富硒蛹虫草栽培后的培养基开发富硒鸡饲料等产品方面的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的富硒蛹虫草的栽培方法，包括以下步骤：

s1、筛选高耐硒蛹虫草菌株；

s2、将步骤s1筛选得到的高耐硒蛹虫草菌株在添加有纳米硒的培养基中进行培养，即得富硒蛹虫草。

本发明中所述的纳米硒为化学合成的纳米硒和/或生物发酵合成的纳米硒。其中，化学合成的纳米硒，其制备可采用zl201410520106.4公开的方法，合成的纳米硒粒径范围为30-300nm。生物发酵合成的纳米硒，其制备可采用cn201510047365.4、cn201610566900.1、cn201610952997.x、cn201610946230.6或cn201610946282.3公开的方法。

前述的方法，步骤s2所述培养基中纳米硒的浓度为2-100mg/l。

前述的方法，步骤s1筛选高耐硒蛹虫草菌株的方法如下：

s11、采集野生蛹虫草，将蛹虫草洗净，用70-75％酒精(优选75％酒精)消毒，将分生孢子梗切成小块；

s12、将过滤灭菌的亚硒酸钠溶液加入到pda培养基中，使培养基中亚硒酸钠的终浓度达到40-60mg/l(优选60mg/l)，倒平板后，将分子孢子梗接种到含亚硒酸钠的平板上，于18-22℃避光培养7-10天，观察菌株生长情况，选择菌丝生长较好的高耐硒菌株，作为富硒蛹虫草的出发菌株；

前述的方法，步骤s2具体如下：

s21、将高耐硒出发菌株接种于pda斜面培养基上，于18-22℃恒温培养箱中培养7-10天，然后将分生孢子转接至装有pd液体培养基的锥形瓶中，装液量为150-200ml/500ml(优选200ml/500ml)，于恒温震荡培养箱中18-22℃，150rpm培养3-5天；

s22、步骤s21所得菌液经稀释5-10倍(优选10倍)后，取5ml稀释菌液接种于装有富含纳米硒培养基的栽培瓶中，于避光、不通风、温度15-18℃，空气相对湿度60-65％的条件下培养4-7天，至菌丝会长满培养基；

s23、菌丝长满后给予光照，保证每日光照时长12h，生长3-5天后，菌丝由白色转变成黄色，待菌丝全部转变为橘黄色后，每日持续光照24h，继续在18-22℃培养40-50天；当子实体生长到5-7cm，顶部膨大，表明蛹虫草子实体成熟，即可采收，得到富硒蛹虫草。

其中，步骤s22所述的富含纳米硒培养基的制备如下：向300ml栽培瓶中加入10-40g大米，10-40mlpd液体培养基，然后加入纳米硒，以封口膜封口，于高压灭菌锅121℃灭菌30min；灭菌结束后冷却至室温，将栽培瓶置于超净台上，开紫外灯灭菌30min。

本发明还提供按照上述栽培方法获得的富硒蛹虫草，其含有2.8-362μg/g有机硒，虫草素和腺苷含量分别为6.8-10.3μg/g、2.2-4.1μg/g，总氨基酸含量为1.8-2.4μg/kg。同时富硒蛹虫草中含有较高的虫草多糖，虫草多糖具有抗氧化活性，清除机体内多余氧自由基，提高免疫力等能力。

本发明还提供所述富硒蛹虫草在制备富硒功能食品、保健品以及饲料产品中的应用。

本发明还提供由所述富硒蛹虫草制备的富硒功能食品、保健品以及饲料产品。开发出的产品包括但不限于富硒蛹虫草糖果压片，富硒蛹虫草胶囊，富硒即食玉米粉，富硒即食小米粉，富硒即食豆粉，富硒蛹虫草保健酒，富硒蛹虫草保健茶以及富硒动物饲料等。

本发明进一步提供一种富硒鸡饲料，制备方法为：利用上述方法制备富硒蛹虫草，富硒蛹虫草收获后，用残留的培养基制成富硒蛹虫草菌饼，然后将富硒蛹虫草菌饼与豆粕，玉米、石粉、维生素、微量元素、食盐、添加剂等原料进行混合复配，即得富硒鸡饲料。

优选地，富硒鸡饲料中硒含量为300-500μg/kg。

在本发明的一个具体实施方式中，富硒鸡饲料的主要配方为：富硒蛹虫草菌饼600-800g，豆粕100-150g，玉米粉200-300g，石粉40-50g，维生素2-3g，微量元素2-4g，食盐0.5-1g，添加剂1-2g。养鸡场每日给鸡饲喂富硒鸡饲料可以使鸡蛋中硒含量达到250-600μg/kg。

本发明通过化学合成以及生物发酵的方法制备纳米硒，利用制备的纳米硒进行蛹虫草的富硒栽培。本发明首次在栽培过程中利用纳米硒获得富硒蛹虫草，并将得到的富硒蛹虫草应用在富硒功能食品、保健品以及饲料产品中。本发明采用的纳米硒，具有环境友好，安全高效等特点。将低毒、高生物活性的纳米硒应用到富硒蛹虫草的栽培过程中使蛹虫草富硒效果显著，并能够通过生物转化全部转化为有机硒形式存在于富硒蛹虫草子实体中。本发明的栽培方法能够获得生长好，易存活，产量高，营养品质高的富硒蛹虫草，有利于进行推广种植，从而提高种植户收入。

附图说明

图1为本发明实施例1中高耐硒蛹虫草菌株的生长情况。

图2为本发明实施例1中富硒蛹虫草子实体。

图3为本发明实施例1中富硒蛹虫草中硒含量测定结果。

图4为本发明实施例1中富硒蛹虫草中硒形态，主要以硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸两种有机硒形式存在。

图5为本发明实施例1中富硒蛹虫草中虫草素、腺苷hplc图谱。

图6为本发明实施例1中富硒蛹虫草中氨基酸图谱。

图7为本发明实施例2中富硒鸡饲料饲养获得鸡蛋中硒含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及的培养基如下：

pda培养基，制备方法为：将200g土豆洗净去皮切块，加入1000ml水，煮至用勺轻压就碎，用多层纱布过滤，向滤液中加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，用1水定容至1000ml，调ph7.0。分装后，用高压灭菌锅121℃，30min灭菌，冷却后备用。

pd液体培养基：土豆200g，葡萄糖20g，水1000ml，ph7.0。

若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”。

实施例1富硒蛹虫草及其栽培方法

1、高耐硒蛹虫草菌株筛选

(1)准备好采集工具，在合适的时间和地点采集野生蛹虫草。

(2)将采集的野生蛹虫草清洗干净，并用75％酒精消毒，将分生孢子梗切成小块。

(3)将过滤灭菌的亚硒酸钠溶液加入到pda培养基中，终浓度达到60mg/l，倒平板后，将分子孢子梗接种到含亚硒酸钠的平板上。置于18-22℃避光培养7-10天，观察菌株生长情况，选择菌丝生长较好的高耐硒菌株(图1)。

2、富硒蛹虫草的栽培

(1)配制pda斜面培养基，灭菌并冷却后接入高耐硒菌种，置于18-22℃恒温培养箱中培养7-10天。

(2)取500ml锥形瓶加入200mlpd液体培养基，灭菌冷却后接入高耐硒菌种，置于恒温震荡培养箱中18-22℃，150rpm，培养3-5天。

(3)在300ml栽培瓶中加入10-40g大米，10-40mlpd液体培养基，加入纳米硒使得硒浓度为2-100mg/l，以封口膜封口后在高压灭菌锅121℃灭菌30min。

(4)待灭菌结束后冷却至室温，放于超净台，开紫外灯灭菌30min。将液体菌种稀释10倍后分别往每瓶中接种5ml菌种。

(5)将接完菌的栽培瓶置于避光、不通风、温度控制在15-18℃，空气相对湿度控制在60-65％，培养4-7天，菌丝会长满培养基。

(6)菌丝长满后打开光照，保证每日光照时长12h，生长3-5天后，白色菌丝会转变成黄色。

(7)待菌丝全部转变为橘黄色后，每日持续光照24h，继续在18-22℃培养至40-50天。

(8)当子实体生长到5-7cm左右，顶部膨大，表明蛹虫草子实体成熟，即可采收(图2)。使用弯头的小铁勺将蛹虫草子实体从根部舀起，晾干或烘干。

3、富硒蛹虫草品质分析

(1)富硒蛹虫草中总硒分析

将栽培获得的富硒蛹虫草进行粉碎，过100目筛。称取0.2g(一式三份)加入10ml浓硝酸，冷浸24h，用微波消解逐级消解1h，冷却定容至100ml容量瓶中。用电感耦合等离子质谱(icp-ms)(美国agilent公司7500a)测定总硒含量，同时配制硒标准系列溶液0，1，5，25，50，100μg/l，绘制标准曲线(硒标准溶液购于中国标准物质中心)，定量为外标法。测定结果发现纳米硒制备的富硒蛹虫草烘干后其中硒含量达到2.8-362μg/g(图3)。

(2)富硒蛹虫草中硒形态分析

将栽培获得的富硒蛹虫草进行粉碎，过100目筛。称取0.2g(一式三份)加入8mg/ml的蛋白酶十四10ml。重复混匀后，在37℃恒温摇床震荡过夜。反应后，样品离心得到上清液，过0.22μm滤膜，用高效液相色谱电感耦合等离子质谱(hplc-icp-ms)分析其中硒形态。标准品硒代胱氨酸(secys2)，硒代蛋氨酸(semet)购于中国标准物质中心，外标法定量。液相色谱工作条件：阴离子交换柱(hamiltonprp-x100)，流动相40mm磷酸氢二铵，ph6。测定结果发现富硒蛹虫草中硒主要以硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸两种有机硒形式存在(图4)。

(3)富硒蛹虫草中虫草素、腺苷分析

将栽培获得的富硒蛹虫草进行粉碎，过100目筛。称取0.5g(一式三份)加入8ml高纯水，超声5h(p>450w,50hz-100hz)60℃，取出后用水定容至10ml，摇匀。取1ml样液，4000rpm离心后，后0.22μm滤膜。

虫草素、腺苷标准品各取10mg(按实际含量折算)，用流动相定容至100ml，摇匀。该混合标准溶液虫草素和腺苷浓度均为100μg/ml，4℃冰箱保存，有效期1个月。分别取0.1ml0.2ml0.5ml1.0ml2.0ml5.0ml母液(100μg/ml)定容至10ml标准曲线浓度1.0μg/l、2.0μg/l、5.0μg/l、10.0μg/l、20.0μg/l、50.0μg/l。高效液相色谱的使用条件，c18，250mm×4.6mm(i.d)5μm；流动相：a乙腈，b1.0％乙酸a:b＝1：99；流速1.0ml/min；柱温35℃；检测波长260nm紫外检测器打开；进样量10μl。纳米硒制备的富硒蛹虫草中虫草素和腺苷含量分别能够达到6.8-10.3μg/g，2.2-4.1μg/g(图5)。显著高于普通蛹虫草中虫草素和腺苷含量。

(4)富硒蛹虫草中氨基酸分析

将栽培获得的富硒蛹虫草进行粉碎，过100目筛。称取300mg左右样品，置于10ml水解玻璃管中；加入7ml-8ml左右的6mol/l的盐酸；拧紧水解管盖，摇匀样品，置于烘箱中加热水解，水解温度为110℃，水解22小时；水解管放置至室温，取出水解管中的样品加入到100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。.摇匀容量瓶，使用针筒式0.2μm滤膜过滤，取2ml滤液置于茄形旋转蒸发瓶中，使用真空旋转蒸发仪除去酸，用蒸馏水清洗一下，蒸干，至接近中性；加入2ml蒸馏水溶解，上机分析。使用仪器型号：l-8900日立氨基酸分析仪(l-8900aminoacidanalyzer)，标准品为：日本和光纯药株式会社的混合标准品，标准品名称：aminoacidsmixturestandardsolution,typeh，定量为外标法。氨基酸分析结果表明，纳米硒制备的富硒的蛹虫草含有的氨基酸种类及含量与普通蛹虫草相比没有显著差异，总氨基酸含量在1.8-2.4μg/kg(图6)。

实施例2富硒蛹虫草在富硒功能食品、保健品以及饲料产品中的应用

1、富硒蛹虫草糖果压片的制备

实施例1制备的富硒蛹虫草含有2.8-362μg/g有机硒，虫草素和腺苷含量分别为6.8-10.3μg/g，2.2-4.1μg/g,总氨基酸含量在1.8-2.4μg/kg。同时富硒蛹虫草中含有较高的虫草多糖，虫草多糖具有抗氧化活性，清除机体内多余氧自由基，提高免疫力等能力。将富硒蛹虫草作为原料，开发富硒蛹虫草压片糖果具很好的休闲和保健效果。

富硒蛹虫草压片糖果主要由30-40％富硒蛹虫草子实体，20-40％玉米淀粉、10-20％酵素粉、15-25％麦芽糊精、0.3-0.7％硬脂酸镁组成，以质量百分比计。

例如，取40％富硒蛹虫草，30％玉米淀粉，10％酵素粉；10％麦芽糊精、9.5％蔗糖、0.5％硬脂酸镁，充分混合后在辐照灭菌1h，压片，即得富硒蛹虫草糖果压片。

每片富硒蛹虫草糖果压片含有20-60μg有机硒，正常人每日摄入1-2片即可满足每日对硒的需求，患病、老人等特殊人群每日摄入4-6颗。富硒蛹虫草压片糖果具有多种保健功能，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用。同时压片糖果携带简便，味道甘甜，食用方便。

2、富硒蛹虫草胶囊的制备

(1)挑选出生长粗壮、色泽金黄的富硒蛹虫草子实体，洗净、晾干，进行冷冻干燥24h，保持富硒蛹虫草中水份含量低于10％。

(2)将冻干后的富硒蛹虫草子实体用高速粉碎机进行粉碎，粉碎后过300-400目筛得到细腻的富硒蛹虫草粉。

(3)将富硒蛹虫草粉0.4g每份分装于食品级天然胶囊中，分装完成后进行辐照灭菌。

(4)每颗富硒蛹虫草胶囊含有20-60μg有机硒，正常人每日摄入1-2颗即可满足每日对硒的需求，患病、老人等特殊人群每日摄入4-6颗。富硒蛹虫草胶囊制备过程方便，无外源物质添加，蛹虫草成分纯净，是较好的补硒佳品。定量食用，能起到很好的保健效果。

3、富硒蛹虫草功能营养粉的制备

(1)富硒蛹虫草玉米粉

富硒即食玉米粉，其组成主要包括：蛹虫草粉、玉米粉、稻米粉。

将富硒蛹虫草烘干后粉碎至细腻，称取20份；挑选干净无霉变，含水量低于10％的优质玉米粒，经清洗、剥皮、破渣、提胚、粉碎，称取100份，加入4％的水拌匀后进行膨化，膨化后过100目筛；挑选新鲜干净无霉变，含水量低于10％的稻米40份，稻米粉碎后加入3％的水拌匀，经膨化后，过100目筛。

将20-60份富硒蛹虫草粉，100-300份膨化玉米粉，40-120份膨化稻米粉，20-60份de20的麦芽糊精充分混合后在辐照灭菌后进行小包分装即为富硒即食玉米粉。每包即食玉米粉含量为10-60g，其中含有10-100μg有机硒。正常人每日摄入1-4包即可满足每日对硒的需求，患病、老人等特殊人群每日摄入2-8包。

(2)富硒蛹虫草小米粉

富硒即食小米粉，主要组成有：富硒蛹虫草粉，小米粉，核桃仁粉，白芝麻粉。

将富硒蛹虫草烘干后粉碎至细腻，称取10-40份；挑选优质的小米，洗净灰尘、米糠，烘干后控制含水量低于10％，再经破渣、提胚、粉碎，称取100份，加入4％的水拌匀后进行膨化，膨化后过100目筛；挑选优质的核桃仁(5-20份)、白芝麻(5-20份)通过清洗，干燥，翻炒。磨粉备用。

将20-60份富硒蛹虫草粉，100-300份膨化小米粉，10-40份核桃仁，10-40份白芝麻充分混合后在辐照灭菌后进行小包分装即为富硒即食小米粉。每包即食小米粉含量为10-60g，其中含有10-100μg有机硒。正常人每日摄入1-4包即可满足每日对硒的需求，患病、老人等特殊人群每日摄入2-8包。

(3)富硒蛹虫草豆粉

富硒即食豆粉，主要组成有：富硒蛹虫草粉，黄豆粉。

将富硒蛹虫草烘干后粉碎至细腻，称取20-60份；挑选优质黄豆，清洗，干燥后，在130℃下烘烤1h，碱液浸泡、去皮、磨浆、将黄豆浆液喷雾干燥、得到黄豆粉100-300份。

将20-60份富硒蛹虫草粉，100-300份黄豆粉充分混合后在辐照灭菌后进行小包分装即为富硒即食豆粉。每包即食豆粉含量为10-60g，其中含有10-100μg有机硒。正常人每日摄入1-4包即可满足每日对硒的需求，患病、老人等特殊人群每日摄入2-8包。

4、富硒蛹虫草保健酒的制备

将富硒蛹虫草与多种滋补类食品进行复配，制备富硒蛹虫草保健酒。

富硒蛹虫草保健酒以富硒蛹虫草为主要材料，辅以杜仲、沙参、玉竹、枸杞、茯苓、枣仁、当归浸入酒中浸泡。每2斤中草药用量配比为：蛹虫草40-200g；枸杞30-40g；杜仲3-6g；沙参，枣仁10-20g；玉竹，茯苓5-10g。

富硒蛹虫草保健酒中有机硒含量在0.5-15μg/ml，成年人每日摄入10-20ml富硒蛹虫草保健能够提高机体免疫力，改善血液循环的作用，同时具有补肾壮阳之功效。

5、富硒蛹虫草保健茶的制备

以富硒蛹虫草为主要原料，辅以甜叶菊，茉莉花，玫瑰花制成富硒蛹虫草保健茶。

富硒蛹虫草保健茶配方：富硒蛹虫草30-40％，甜叶菊5-10％，茉莉花5-10％，玫瑰花5-10％。

将富硒蛹虫草、甜叶菊、茉莉花、玫瑰花烘干控制水份在10％以下。通过配方复配以后分装，进行灭菌。

富硒蛹虫草保健茶颜色清亮，含有虫草素、腺苷、硒、黄酮等多种活性物质，能够增强人体免疫力抗疲劳。

富硒蛹虫草保健茶中有机硒含量在40-100μg/g，成年人每日摄入2-4g富硒蛹虫草保健能够提高机体免疫力，改善血液循环的作用，同时具有补肾壮阳之功效。

实施例3富硒蛹虫草栽培过程中附加产品的应用

富硒鸡饲料的制备：

(1)纳米硒在制备富硒蛹虫草的过程中，富硒蛹虫草收获后会有大量富硒培养基保留。

(2)富硒蛹虫草剩余培养基被蛹虫草菌丝吃透，培养基中硒含量达到1-200μg/g。同时培养基含有大量的虫草素、腺苷、氨基酸等营养物质。

(3)富硒鸡饲料主要以纳米硒制备富硒蛹虫草过程中产生的富硒蛹虫草菌饼为原料，配合豆粕，玉米、石粉、维生素、微量元素、食盐、添加剂。

(4)富硒鸡饲料的主要配方：富硒鸡饲料的主要配方为：富硒蛹虫草菌饼600-800g，豆粕100-150g，玉米粉200-300g，石粉40-50g，维生素2-3g，微量元素2-4g，食盐0.5-1g，添加剂1-2g。

(5)富硒鸡饲料中硒含量在300-500μg/kg，养鸡场每日给鸡饲喂富硒鸡饲料，饲喂20天后，可以使鸡蛋中硒含量达到250-600μg/kg，鸡肉硒含量达到160-280μg/kg(图7)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。