本发明属于以等温扩增为代表的分子生物学检测方法在肺炎支原体检测方面的应用，即肺炎支原体的环介导等温扩增检测技术及其专用引物、检测方法和试剂盒。
背景技术：
支原体(mycoplasma)是介于细菌与病毒之间的一种原核细胞型微生物。迄今为止，能够导致人体感染的支原体大约有20种，其中以肺炎支原体(m.pneumoniae,mp)最为多见。mp是引起人类呼吸道感染的重要病原菌之一，每年约有10％～30％的社区获得性肺炎是由其感染引起。mp感染呈全球性分布，它可以通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，人群普遍易感。当mp侵入呼吸道后，借滑行运动定位于纤毛毡的隐窝内，以其尖端特殊结构(顶器)牢固的黏附于上皮细胞表面的受体上，抵抗黏膜纤毛的清除和吞噬细胞的吞噬，由此在呼吸道立足。除呼吸道感染外，mp还可引发严重的肺外并发症，常累及中枢神经系统、心血管系统、皮肤及肝肾器官等。此外，有研究报道mp感染还是某些自身免疫病(如自身免疫性溶血性贫血)的风险因素，因此，对于临床上疑似mp感染的患者进行早期实验室诊断变得尤为重要。
目前支原体的实验室诊断金标准为分离培养，但分离培养法通常存在两个弊端，一是检测时间过长，固体平板生长出典型菌落至少需要3周时间，对临床快速诊断意义不大。二是分离培养难度大、要求苛刻，一般医院和实验室难以推广。尽管指示细胞培养法能大大缩短分离培养所需时间，但培养过程中菌株容易死亡，亦不适用于临床快速检测。血清学方法在临床上广泛使用，尽管一些商品化试剂盒市面有售，但各试剂盒的包被抗原不同以及临界值设定不同导致各试剂盒的特异性和敏感性存在差异。此外，血样的采集时间和患者年龄对依赖血清学方法的实验室诊断影响较大，而某些支原体在血清学上又存在交叉反应性。pcr的出现虽克服了传统实验敏感度低的弊端，但需要特殊仪器，不以普及，亦不适用于基层单位、现场监测和床旁检测。因此，开发一种针对mp的即时检验方法成为了临床和实验室中亟待解决的问题。
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是一种新型等温核酸扩增技术，它具有简便、快速、经济、灵敏等优点，近年来发展迅速，已被广泛应用于核酸快速检测领域。lamp的原理是针对靶基因上6个区域设计2对引物(fip[f1c+f2]、bip[b2+b1c]、f3、b3)，在链置换型dna聚合酶的作用下，于等温条件在短时间内(15～60min)进行核酸扩增。在dna扩增反应中，当一个dntp分子结合到dna链上时会解离下一个焦磷酸根离子，后者与镁离子结合形成大量副产物焦磷酸镁，反应结果无需电泳检测，肉眼可见白色沉淀，加入荧光染料后可观察到绿色荧光。与传统pcr相比，lamp具有操作简便、灵敏度高、特异性强，判定简单，成本低廉等特点。其检测灵敏度至少高于普通pcr2个数量级。此外，等温扩增仅需一个水浴锅或恒温装置，对设备的要求简单，其操作过程耗时较短，可在1小时内完成。lamp反应结果的检测不需要像普通pcr进行凝胶电泳，只需通过肉眼观察白色浑浊或者绿色荧光即可，是一种简便、快捷、高通量的检测方法。
lamp在国内外已有报道其在肺炎支原体检测方面的应用，但是迄今为止，市场上还未见用于检测mp的lamp专用引物与试剂盒问世。因此开发一种针对mp的快速可靠的核酸检测方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的主要内容是提供一种用于检测mp的lamp检测专用引物、检测方法及试剂盒，该法不依赖于dna提纯过程，粗提模板亦可进行等温扩增，尤其适用于各基层单位及现场监测。
1.mp的lamp检测专用引物
引物设计靶点为mycoplasmapneumoniam129chromosome，completegenome，ncbireferencesequencenc_000912.1
根据lamp引物设计的关键因素，主要包括引物末端的稳定性、gc含量、引物间的距离和二级结构对其进行筛选，最终得到的lamp引物。具体来说，为了在反应中能使f1c和b1c更加容易弯转，可以形成双茎环结构，引物f1c和b1c要高于其他几条引物的tm值5℃左右。为提高核苷酸越与模板退火结合效率，每条引物最末端的六个碱基的吉普斯自由能变⊿g值<＝-4kcal/mol，f3/b3，f2/b2，lf/lb的3’末端⊿g值<＝-4kcal/mol，f1c和b1c的5’端的⊿g值<＝-4kcal/mol。对于引物的gc含量设定范围在40～60％之间。对于引物之间的距离，从f2的5’端到b2的5’端应在120～180bp之间，从f2的5’端到f1c的3’端也就是茎环段在40～60bp之间，从f2的5’端到f3的3’端在0～20bp之间。最后要特别注意引物之间不能形成二级结构。通过以上设计原则筛选即得到最终引物如下。f35’-gtgagtgggtggcttgtg-3’；b35’-tgtggaccagtgtcagct-3’；fip5’-aacccccaccacatcattccccaagcacgagtgacggaa-3’；bip5’-ctttctgaaagcaacgccgcaa-ccccatctaacagttcagcg-3’。
2.mp的lamp检测方法
本发明所提供的mp的lamp检测方法，主要包括以下步骤：
[1]dna提取：采用粗提、商品化试剂盒提取dna或纯化dna均可。
1)粗提：样本不经过提纯，直接煮沸10min后收集上清亦可作为lamp模板进行等温扩增。
2)纯化：可采用商品化试剂盒，或传统酚氯仿等方法进行提取。
[2]lamp扩增
以上述提取的待测物基因组dna为模板，在专用引物的介导下进行扩增。其中，25μllamp反应体系包括：含uu、mg或mh的基因组dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱(betaine)，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase(购自neb公司)，引物用量为：5pmolf3和b3，40pmolfip和bip。lamp扩增条件可设定为55～67℃恒温30～90min(推荐设置63℃60min)。
[3]结果判定
1)肉眼观察
反应结束后，肉眼观察产物是否浑浊。与阴性对照相比，明显出现浑浊物的样本为阳性，阳性产物经离心后在试管底部出现沉淀物。若无浑浊现象，则为阴性标本。
2)荧光显色
反应结束后加入1μlsybr(1:100稀释),在紫外光激发下观察结果，产物呈荧光绿色表示该样品存在支原体感染，颜色无变化表示待测样品中不存在支原体。
3)检测浊度
使用浊度测定仪器，可间接反应核酸扩增情况。阳性样品的浊度随反应时间的延长呈s型上升趋势，浊度无变化表示待检样品中不存在支原体感染。根据仪器功能不同，可检测实时浊度或终点浊度，评估反应前后浊度的变化来判断结果。
3.mp的lamp检测试剂盒
本发明所提供的mp的lamp检测试剂盒，包含有上述lamp检测的专用引物、主要试剂和反应参数，本发明具有以下优点：
[1]高特异性
4条引物对支原体靶序列的6个特异区域的识别保证了lamp扩增的高度特异性，即lamp能够从相差仅一个核苷酸的基因标本中寻找出相应的靶序列进行扩增；
[2]高效扩增
灵敏度比普通pcr高约100倍；
[3]操作简便
只需将待检样品(靶核酸)和检测试剂置于约63℃恒温水浴锅中60min左右即可判断结果；
[4]结果直观
可通过肉眼、浊度仪判断或添加荧光指示剂观察结果。本发明可以在等温条件下简便快速(63℃60min)、高效特异地检测到mp。该法不需要复杂仪器，为支原体的检测提供了一个新的技术平台，尤其适用于人群筛查，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
具体实施方式
现以本发明技术方案为前提，列举出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例子。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、用于对mp进行lamp检测的引物设计
从美国基因数据库检索获得mp特异性保守靶序列(mycoplasmapneumoniam129chromosome，completegenome，ncbireferencesequencenc_000912.1)，应用在线引物设计软件primerexplorerv5，上传靶序列后，即可初步得到多组引物序列。根据lamp引物设计的关键因素，主要包括引物末端的稳定性、gc含量、引物间的距离和二级结构对其进行筛选，最终得到的lamp引物(详见发明内容)。
实施例2、本发明mp的lamp检测方法的建立
用实施例1获得的用于对mp进行lamp检测的引物对咽拭子标本进行lamp检测，具体操作步骤如下：
[1]反应体系
采用天根细菌基因组dna提取试剂盒提取待测样品中的核酸或煮沸10min后收集上清作为模板，在实施例1获得的lamp专用引物的引导下进行等温扩增。其中，25μllamp反应体系包括：含mp的基因组dna2μl，20mmtris·hcl(ph8.8)，10mmkcl，8mmmgso4，10mm(nh4)2so4，0.1％tween20，0.8m甜菜碱(betaine)，1.4mmdntpeach，8ubstdnapolymerase(购自neb公司)，引物用量为：5pmolf3和b3，40pmolfip和bip。
[2]结果判定
反应结束后肉眼观察产物是否浑浊。与阴性对照相比，明显出现浑浊物的样本为阳性，阳性产物经离心后在试管底部出现沉淀物。若无浑浊现象，则为阴性标本。亦可在反应液中添加1μl的sybrgreen(1:100稀释)，在紫外光激发下观察结果，产物呈荧光绿色表示该样品存在支原体感染，颜色无变化表示待测样品中不存在支原体感染。或利用浊度仪监测反应中的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在mp(阳性)，浊度无变化表示待测样品为阴性。
实施例3、制备mp的lamp检测试剂盒
将lamp反应发生混合物即特异扩增引物(5pmolf3；5pmolb3；40pmolfip；40pmolbip)、bstdna聚合酶(8u)、2×反应缓冲液(40mmtris-hcl，ph8.8；20mmkcl；16mmmgso4；20mm(nh4)2so4；0.2％tween20；1.6mbetaine；2.8mmdntpeach)、sybrgreen和阳性对照共同包装，得到本发明mp的lamp检测试剂盒。