本发明属于生物制药
技术领域:
,具体涉及一种硫酸软骨素钠的制备方法。
背景技术:
:硫酸软骨素钠是从动物组织中提取的一种酸性粘多糖类物质,多存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨、牛马中膈和气管中,其分子结构为β-d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基半乳糖通过β1→3糖苷键形成的重复二糖单位所组成的多糖链。硫酸软骨素钠主要用于治疗风湿和类风湿疾病的药物,还具有抗凝、抗癌、抗血栓、降血脂等作用,可用于治疗头痛、偏头痛、冠心病、心绞痛等症状。目前硫酸软骨素钠采用的是碱盐消化沉淀法,即软骨经碱化后,酶解、过滤后用酒精直接沉淀,按此方法生产硫酸软骨素钠含量和纯度均较低。技术实现要素:针对现有技术中的上述不足,本发明提供了一种硫酸软骨素钠的制备方法,可有效解决现有技术生产硫酸软骨素钠含量和纯度均较低的问题。为实现上述目的,本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种硫酸软骨素钠的制备方法,包括以下步骤:(1)提取:将猪软骨和水按重量比为1:3-5混合,加热煮沸20-40min,然后加入2-3%猪软骨重量的氯化钠,再用氢氧化钠溶液调节ph值至8-11;(2)超声波酶解:向步骤(1)所得物中加入复合酶,混合,在以超声为介质的条件下进行酶解,超声时间为20-30min,超声功率为250-300w,单次超声时间为2-4s,超声时间与间歇时间比为2-5:1,然后离心,过滤,得滤液;其中,所添加的复合酶占步骤(1)所得物重量的2-5%;(3)微波提取:向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶,混合,然后置于微波提取器中提取,微波功率为250-300w,提取时间为5-10min;其中,所添加的复合酶占步骤(2)所得物重量的1-3%;(4)酶解:向步骤(3)所得物中加入蛋白酶,用氢氧化钠溶液调节ph值至8-10,置于50-60℃条件下搅拌40-60min,再用盐酸调节ph值至6-6.5,静置,过滤,得滤液;其中,所添加的蛋白酶占步骤(3)所得物重量的2-4%;(5)沉淀:将步骤(4)所得滤液温度维持在50-60℃,加入95%乙醇,静置至沉淀量不再增加,过滤,得沉淀物;其中,步骤(4)所得滤液与95%乙醇的体积比为2-3:1;(6)脱色:将步骤(5)所得沉淀物加入氯化钠溶液溶解,用氢氧化钠溶液调节ph值至8-10,再将溶液升温至35-40℃,加双氧水静置氧化脱色2-3h,过滤,得滤液;其中,所加氯化钠溶液的质量浓度为2-5%,沉淀物占氯化钠溶液重量的10-15%,双氧水占氯化钠溶液的0.5-0.8%;(7)沉淀:将步骤(6)所得滤液用盐酸调节ph值至5.8-6.0,然后加乙醇使沉淀度数达60-70度,沉淀5-8h,再向沉淀物中加乙醇,使沉淀度数达80-90度,沉淀5-8h,收集沉淀物;(8)脱水:向步骤(7)所得沉淀物中加75%乙醇浸泡2次,真空干燥,得硫酸软骨素钠成品。进一步地,步骤(2)中所添加的复合酶占步骤(1)所得物重量的3%。进一步地,复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为6-8:0.8-1.2:0.2-0.4混合的混合物。进一步地,复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.0:0.2混合的混合物。进一步地,蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万u/g。进一步地,步骤(2)中超声时间为30min,超声功率为280w,单次超声时间为3s,超声时间与间歇时间比为4:1。进一步地,步骤(3)中微波功率为280w,提取时间为8min。进一步地,步骤(3)中所添加的复合酶占步骤(2)所得物重量的1.8%。进一步地,步骤(4)中所添加的蛋白酶占步骤(3)所得物重量的2.5%。进一步地,步骤(7)中加乙醇使沉淀度数达65度,沉淀8h,再向沉淀物中加乙醇,使沉淀度数达80度,沉淀6h。本发明提供的一种硫酸软骨素钠的制备方法,具有以下有益效果:利用超声波提取硫酸软骨素钠主要是运用超声波的机械效应和空化作用。超声波的机械作用可促成液体的乳化、凝胶的液化和固体的分散,当超声波流体介质中形成驻波时,悬浮在流体中的微小颗粒因受机械力的作用而凝聚在波节处,在空间形成周期性的堆积;超声波的空化作用是指超声波作用于液体的时候可以产生大量小气泡,一个原因是由于液体内局部出现拉应力而形成负压,压强的降低使原来溶于液体的气体过饱和,而从液体逸出,成为小气泡;另一个原因是由于强大的拉应力把液体“撕开”成一空洞,成为空化。空洞内为液体蒸汽或溶于液体的另一种气体,甚至可能是真空,因为空化作用形成的小气泡会随周围介质的振动而不断运动,长大或突然破灭,破灭时周围液体突然冲入气泡而产生高温、高压,同时产生激波,这种作用力能破坏细胞膜的结构,使细胞在瞬间破裂,超声波的这些作用都有助于硫酸软骨素钠的提取。在超声波为介质的条件下酶解,即将超声波导入溶液中,在超声波破坏细胞膜的情况下,通过酶解过程使细胞内的硫酸软骨素钠和蛋白质分离,肝素保留于溶液中,而蛋白质成为固体杂渣,通过离心过滤,便可将硫酸软骨素钠与蛋白质初步分离。此过程所用的酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶混合的复合酶,三者酶按照特定的比例关系复合,有利于去除与硫酸软骨素钠连接的蛋白质,并且在酶解过程不需额外加热,便可将蛋白质去除。将超声波酶解后所得滤液在微波场的作用下引起强烈的极性震荡,从而导致细胞分子间氢键松弛,细胞膜结构电击穿破裂,加速了细胞膜的通透性,从而有助于硫酸软骨素钠的提取。在超声波震荡前,向滤液中加入了复合酶,然后一起进行超声波振动,使其在破坏细胞膜结构,增加细胞膜通透性的情况下,直接用复合酶对连接硫酸软骨素钠的蛋白质进行酶解,使其与硫酸软骨素钠得到进一步的分离。经过超声波酶解和微波提取过程后,硫酸软骨素钠上还连接有蛋白质,通过进一步的蛋白质酶解过程,使其剩余蛋白质得到更好的去除,有利于提供硫酸软骨素钠的纯度和收率。超声波酶解、微波提取和蛋白质酶解,三个过程依次进行,协同将硫酸软骨素钠从猪软骨上提取出来,提高其收率和纯度。步骤(5)沉淀过程中滤液温度要维持在50-60℃,可使硫酸软骨素钠缓慢沉淀,减少蛋白杂质与硫酸软骨素钠共沉淀现象,操作时加乙醇速度要慢,边加边搅拌,可减少硫酸软骨素钠沉淀时对蛋白质的包裹。通过上述环环相扣的步骤,使得硫酸软骨素钠的产量和纯度得以显著提高,降低了生产成本,提高了经济效益。具体实施方式实施例1一种硫酸软骨素钠的制备方法,包括以下步骤:(1)提取:将猪软骨和水按重量比为1:3混合,加热煮沸30min,然后加入2%猪软骨重量的氯化钠,再用氢氧化钠溶液调节ph值至10;(2)超声波酶解:向步骤(1)所得物中加入复合酶,混合,在以超声为介质的条件下进行酶解,超声时间为30min,超声功率为250w,单次超声时间为2s,超声时间与间歇时间比为2:1,然后离心,过滤,得滤液;其中,所添加的复合酶占步骤(1)所得物重量的5%;复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为6:0.8:0.2混合的混合物,蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万u/g;(3)微波提取:向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶,混合,然后置于微波提取器中提取,微波功率为250w,提取时间为10min;其中,所添加的复合酶占步骤(2)所得物重量的1%;复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为6:0.8:0.2混合的混合物,蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万u/g;(4)酶解:向步骤(3)所得物中加入蛋白酶,用氢氧化钠溶液调节ph值至10,置于60℃条件下搅拌40min,再用盐酸调节ph值至6.5,静置,过滤,得滤液;其中,所添加的蛋白酶占步骤(3)所得物重量的2%;(5)沉淀:将步骤(4)所得滤液温度维持在60℃,加入95%乙醇,静置至沉淀量不再增加,过滤,得沉淀物;其中,步骤(4)所得滤液与95%乙醇的体积比为2:1;(6)脱色:将步骤(5)所得沉淀物加入氯化钠溶液溶解,用氢氧化钠溶液调节ph值至10,再将溶液升温至40℃,加双氧水静置氧化脱色2h,过滤,得滤液;其中,所加氯化钠溶液的质量浓度为2%,沉淀物占氯化钠溶液重量的10%,双氧水占氯化钠溶液的0.5%;(7)沉淀:将步骤(6)所得滤液用盐酸调节ph值至6.0,然后加乙醇使沉淀度数达60度,沉淀5h,再向沉淀物中加乙醇,使沉淀度数达80度,沉淀5h,收集沉淀物;(8)脱水:向步骤(7)所得沉淀物中加75%乙醇浸泡2次,真空干燥,得硫酸软骨素钠成品。实施例2一种硫酸软骨素钠的制备方法,包括以下步骤:(1)提取:将猪软骨和水按重量比为1:5混合,加热煮沸40min,然后加入3%猪软骨重量的氯化钠,再用氢氧化钠溶液调节ph值至11;(2)超声波酶解:向步骤(1)所得物中加入复合酶,混合,在以超声为介质的条件下进行酶解,超声时间为30min,超声功率为300w,单次超声时间为4s,超声时间与间歇时间比为5:1,然后离心,过滤,得滤液;其中,所添加的复合酶占步骤(1)所得物重量的2%;复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.2:0.4混合的混合物,蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万u/g;(3)微波提取:向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶,混合,然后置于微波提取器中提取,微波功率为300w,提取时间为10min;其中,所添加的复合酶占步骤(2)所得物重量的3%;复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.2:0.4混合的混合物,蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万u/g;(4)酶解:向步骤(3)所得物中加入蛋白酶,用氢氧化钠溶液调节ph值至10,置于50℃条件下搅拌60min,再用盐酸调节ph值至6,静置,过滤,得滤液;其中,所添加的蛋白酶占步骤(3)所得物重量的4%;(5)沉淀:将步骤(4)所得滤液温度维持在50℃,加入95%乙醇,静置至沉淀量不再增加,过滤,得沉淀物;其中,步骤(4)所得滤液与95%乙醇的体积比为3:1;(6)脱色:将步骤(5)所得沉淀物加入氯化钠溶液溶解,用氢氧化钠溶液调节ph值至10,再将溶液升温至35℃,加双氧水静置氧化脱色3h,过滤,得滤液;其中,所加氯化钠溶液的质量浓度为5%,沉淀物占氯化钠溶液重量的15%,双氧水占氯化钠溶液的0.8%;(7)沉淀:将步骤(6)所得滤液用盐酸调节ph值至5.8,然后加乙醇使沉淀度数达70度,沉淀8h,再向沉淀物中加乙醇,使沉淀度数达90度,沉淀5h,收集沉淀物;(8)脱水:向步骤(7)所得沉淀物中加75%乙醇浸泡2次,真空干燥,得硫酸软骨素钠成品。实施例3一种硫酸软骨素钠的制备方法,包括以下步骤:(1)提取:将猪软骨和水按重量比为1:5混合,加热煮沸40min,然后加入2.5%猪软骨重量的氯化钠,再用氢氧化钠溶液调节ph值至11;(2)超声波酶解:向步骤(1)所得物中加入复合酶,混合,在以超声为介质的条件下进行酶解,超声时间为30min,超声功率为280w,单次超声时间为3s,超声时间与间歇时间比为4:1,然后离心,过滤,得滤液;其中,所添加的复合酶占步骤(1)所得物重量的3%;复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.0:0.2混合的混合物,蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万u/g;(3)微波提取:向步骤(2)所得滤液中继续加入复合酶,混合,然后置于微波提取器中提取,微波功率为280w,提取时间为8min;其中,所添加的复合酶占步骤(2)所得物重量的1.8%;复合酶为蛋白酶、脂肪酶和核酸酶按质量比为8:1.0:0.2混合的混合物,蛋白酶、脂肪酶和核酸酶酶活均为3.5万u/g;(4)酶解:向步骤(3)所得物中加入蛋白酶,用氢氧化钠溶液调节ph值至10,置于55℃条件下搅拌50min,再用盐酸调节ph值至6.5,静置,过滤,得滤液;其中,所添加的蛋白酶占步骤(3)所得物重量的2.5%;(5)沉淀:将步骤(4)所得滤液温度维持在55℃,加入95%乙醇,静置至沉淀量不再增加,过滤,得沉淀物;其中,步骤(4)所得滤液与95%乙醇的体积比为3:1;(6)脱色:将步骤(5)所得沉淀物加入氯化钠溶液溶解,用氢氧化钠溶液调节ph值至10,再将溶液升温至37℃,加双氧水静置氧化脱色3h,过滤,得滤液;其中,所加氯化钠溶液的质量浓度为3%,沉淀物占氯化钠溶液重量的12%,双氧水占氯化钠溶液的0.6%;(7)沉淀:将步骤(6)所得滤液用盐酸调节ph值至6.0,然后加乙醇使沉淀度数达65度,沉淀8h,再向沉淀物中加乙醇,使沉淀度数达80度,沉淀6h,收集沉淀物;(8)脱水:向步骤(7)所得沉淀物中加75%乙醇浸泡2次,真空干燥,得硫酸软骨素钠成品。实施例1-3所制得的硫酸软骨素钠成品色泽洁白,粉末疏松,收率达32%以上,降低了生产成本,提高了经济效益。将实施例1-3所得硫酸软骨素钠成品进行分析,结果如下:实施例1实施例2实施例3比旋度-26.1°-26.9°-27.8°420nm吸光度0.1940.1890.163酸度6.626.536.41总氮量3.0%2.9%2.8%干燥失重9.0%8.3%8.0%炽灼残渣27.8%26.1%25.2%有机残留3771ppm3002ppm2558ppmcpc含量95.5%96.2%96.7%hplc含量93.1%95.2%97.5%当前第1页12