一种免疫原性强的血清2型猪链球菌及其应用的制作方法

本发明属于兽医生物制品技术领域，具体涉及一种免疫原性强的血清2型猪链球菌及其应用。

背景技术：

猪链球菌(streptococcussuis,ss)是一种世界性的可引起猪重大疾病的重要病原菌之一，同时它也是一种人兽共患病病原体。人感染猪链球菌的途径主要是接触病死猪，致病菌经破损皮肤和黏膜侵入，或食入未煮熟的病死猪肉而感染。近年来，人感染猪链球菌的报道大量增加，而这些病例主要来自亚洲国家。我国于2005年在四川省爆发的猪链球菌疫情共感染215人，病死率将近20％。

目前公认的猪链球菌的血清型有33种(1-31，33，1/2)，经流行病学分析，临床上猪链球菌主要以2、7、9型是引起猪感染的重要流行血清型，血清2型致病力最强，极易引起人的感染和死亡。

由于临床中常大量不合理使用抗生素来控制细菌性疾病，致使猪场的细菌在抗生素的压力下进化出耐药菌群。因此，用药物防控猪链球菌的难度越来越大，而且随着人们对食品安全问题的重视，抗生素在动物疫病防控中的应用会越来越少，疫病的防控更多的会依赖疫苗。猪链球菌血清型众多，且不同血清型之间的毒力和致病力差异较大，各血清型之间的交叉保护很低，所以，目前已有的商品化疫苗均不能对该病提供完全的免疫保护。因此，筛选免疫原性强并具有交叉保护力的猪链球菌通用菌株，是制备高效的猪链球菌疫苗的关键所在。

技术实现要素：

本发明的目的在于一种免疫原性强的血清2型猪链球菌及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种猪链球菌，该猪链球菌的保藏编号为gdmccno：60188，记名为猪链球菌gdzq株。

本发明提供的猪链球菌gdzq株，于2017年05月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所)，保藏号为：gdmccno：60188，保藏中心建议的分类命名为streptococcusporcinus。保藏中心于2017年05月18日鉴定菌株是存活的。

上述猪链球菌在制备防控猪链球菌病的药物中的应用。

优选的，所述的药物为疫苗。

一种疫苗，是用上述所述的猪链球菌作为抗原制备的。

优选的，所述的疫苗为灭活疫苗。

优选的，所述疫苗中的佐剂为铝胶。

优选的，所述的疫苗为单价疫苗。

优选的，所述的猪链球菌的含量为1×10⁸～3×10¹²cfu/ml。

本发明的有益效果是：

本发明申请人从160多株菌株中筛选出一株血清2型猪链球菌，记名为猪链球菌gdzq株，其毒力较强，5×10⁸cfu即可引起全部试验仔猪死亡；免疫原性强，疫苗抗原含量仅需1×10⁸cfu即可对试验仔猪产生100％的免疫保护，优于目前市面上的同类产品。此外猪链球菌gdzq具有较好的交叉保护力，能保护猪免受目前国内主要的流行血清2、7、9型猪链球菌的侵害。

利用本发明筛选出的猪链球菌gdzq制备猪链球菌疫苗，工艺简单，仅需单独培养猪链球菌gdzq，经常规处理即可制备得到猪链球菌疫苗。本发明技术工艺简单，成本低廉，可以克服目前市场上多价猪链球菌疫苗生产中工艺繁琐的缺陷。

本发明克服现有技术的不足，提供了预防猪猪链球菌病的单价疫苗，可以弥补市场的空白。所述单价疫苗具有较好的交叉保护力，利用其对猪进行免疫接种，可以抵御国内主要的猪链球菌流行血清型2、7、9型菌株的侵害，市场前景广阔。

附图说明

图1为血平板培养结果；

图2为革兰氏染色结果；

图3为猪链球菌pcr鉴定结果；

图4为猪链球菌血清型分型结果。

具体实施方式

实施例1猪链球菌gdzq株的分离、鉴定和毒力试验

一、猪链球菌菌株的分离和筛选

1、猪链球菌菌株的分离

2015年于广东肇庆某猪链球菌发病猪场采集病料，无菌取发病猪的脑组织，接种到tha琼脂培养基上，置37℃培养24～36h后挑选典型的单个菌落进行纯化培养。挑选纯化好的单菌落接种于thb液体培养液中，37℃摇床(220r/min)培养过夜。纯培养物接种含绵羊血的琼脂平板，37℃培养24h后，可见形成直径1～2mm透明，圆润的菌落，在血平板中呈β溶血(图1)。挑取上述单菌落进行革兰氏染色，显微镜下观察，可见蓝紫色，卵圆形或圆形，成双或成链状的菌落分布于视野中(图2)，初步判断为链球菌。

2、猪链球菌菌株的筛选

对初步证实是猪链球菌菌株的160多株菌株进行筛选。经毒力、生长特性等的比对验证，最终筛选出易于培养、毒力较强的猪链球菌1株，进行如下研究。

二、猪链球菌菌株的16srrna鉴定

对毒力最强的猪链球菌菌株进行16srrnapcr鉴定，引物序列如下：

p1：5’-cagtatttaccgcatggtagatat-3’(seqidno:1)；

p2：5’-gtaagataccgtcaagtgagaa-3’(seqidno:2)。

经pcr检测可疑菌落扩增出大小约为294bp的特异性条带(图3)，pcr产物送上海生工生物公司进行序列测定，测序结果与ncbigenbank中已有序列比对，比对结果显示，分离到的菌株为猪链球菌。将菌株命名为gdzq株。

三、猪链球菌gdzq株的血清型鉴定

1凝集试验

将上述鉴定为猪链球菌的菌株gdzq进行血清凝集试验，取10l标准阳性血清于玻片上，取10l纯化的猪链球菌菌液充分混匀，轻轻摇动3分钟，日光灯下观察结果，若有颗粒状物质出现，则为阳性；若为均匀混悬液，则为阴性。经鉴定猪链球菌gdzq株为血清型2型。

2pcr定型

用pcr方法对菌株gdzq株进行血清型定型。定型引物为：

cps2i-f：ttcgtattaacttacttggcgt(seqidno:3)；

cps2i-r：taaatccccatatgccaaatcc(seqidno:4)。

pcr的结果显示gdzq株为血清型2型，见图4。

四、.猪链球菌gdzq株的致病力研究

取20头15日龄仔猪随机分成a、b、c、d四组，每组5头，进行猪链球菌攻毒，剂量及分组如表1。

表1猪链球菌gdzq株攻毒结果

每头猪分别颈部肌肉注射，每天观察仔猪发病情况，连续观察10天。试验结果显示，a、b、c所有试验仔猪于攻毒后48h均开始表现出卧地不起，食欲废绝，呼吸困难，呼吸罗音，并出现抽搐，四肢划水状等一系列神经症状，d组有3头仔猪于攻毒后4天出现上述症状，对照组仔猪正常。试验证实，猪链球菌gdzq株对仔猪有较强的致病力。

实施例2猪链球菌疫苗的制备以及免疫效力检测

一、猪链球菌疫苗的制备

通过以下步骤制备疫苗：

1)一级种子液制备：取冻干保存的猪链球菌gdzq株接种于tsa固体平板，在温度为37℃的条件下培养18h；然后挑取单菌落于tsb培养基(含5％新生牛血清)中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养18h，进行纯粹检验合格后，作为一级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天。

2)二级种子液制备：取步骤1)得到的一级种子液，按种子液与培养基的体积比1:20接种于tsb培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养16h，进行纯粹检验合格后，作为二级种子液，置2～8℃保存备用，保存时间均不超过3天。

3)原菌液制备：取步骤2)得到的二级种子培养液，按种子液与培养基的体积比1:100接种于tsb培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速120rpm振荡培养24h后，得到原菌液。

4)活菌计数：将步骤3)中获得的菌液进行活菌计数，步骤如下：

取猪链球菌gdzq株菌液1ml，用ph7.4pbs做10倍系列稀释，每个稀释度换1支吸管。具体方法是：准确吸取菌液100μl，放入盛有稀释液900μl的第一支1.5ml离心管中(不接触液面)，另取1支1ml枪头将第一管液体混合均匀后，吸取100μl放入盛有稀释液900μl的第2支1.5ml离心管中，依次稀释至最后1管。根据对样品含菌数的估计，选择适宜稀释度，吸取最终稀释度的菌液接种适宜的培养基平板3个，每个滴100μl，使菌液散开，置37℃凉干后，翻转平板，培养48～72h，按照下列方法数出每个平皿中的菌落个数，计算每ml菌液中的活菌数(cfu/ml)。

5)灭活：在上述步骤3)制备的菌液中加入终浓度为0.2～0.4％的甲醛溶液，37℃振荡灭活24h。

6)乳化：在步骤5)得到的灭活菌液中取样，按照《中华人民共和国兽药典》附录进行纯粹检验；将原菌液在转速为8000rpm的条件下无菌离心10min取沉淀的菌体，用无菌生理盐水重悬菌体后洗涤，经洗涤的菌体用无菌生理盐水稀释成浓度为2×10⁸cfu/ml的制苗菌液，将制苗菌液与铝胶佐剂以体积比4：1～9:1混合，转速8000rpm的条件下乳化20min，得到治疗猪链球菌病的疫苗，2～8℃保存备用。

二、猪链球菌疫苗的免疫效力检测

1.最小免疫效力试验

取25头15日龄仔猪，随机分成a、b、c、d、e共5组，每组5头，其中a组仔猪颈部肌肉注射猪链球菌gdzq株灭活疫苗，0.5ml/头，14天后二免，0.5ml/头；b组仔猪颈部肌肉注射猪链球菌gdzq株灭活疫苗，1ml/头，14天后二免，1ml/头；c组仔猪颈部肌肉注射猪链球菌gdzq株灭活疫苗，2ml/头，14天后二免，2ml/头；d组颈部肌肉注射市售猪链球菌商品疫苗，2ml/头，14天后二免，2ml/头；e组仔猪分别注射生理盐水，2ml/头。所有实验组在二免14天后分别用猪链球菌血清2型菌株进行攻毒，3×10⁹cfu/头，连续观察10天，观察记录仔猪发病和死亡情况，计算每组保护率，如表2所示。

表2猪链球菌gdzq株灭活疫苗对仔猪的免疫保护结果

表2结果显示，猪链球菌gdzq株灭活疫苗对仔猪能产生较好的免疫保护效力，免疫0.5ml，1ml、2ml组的保护率均为100％，即疫苗的抗原含量为1×10⁸cfu可对仔猪形成较好的免疫保护，商品疫苗免疫组有40％仔猪发病，攻毒对照组仔猪100％发病。

2.交叉保护试验

取30头15日龄仔猪，随机分成a、b、c、d、e、f6组，每组5头，其中a、b、c组仔猪颈部肌肉注射猪链球菌gdzq株灭活疫苗，2ml/头，14天后二免，2ml/头；d、e、f组仔猪颈部肌肉注射生理盐水，2ml/头，14天后二免，2ml/头。a、d组在二免14天后分别用2型标准菌株进行攻毒，3×10⁹cfu/头；b、e组在二免14天后分别用7型菌株进行攻毒，3×10⁹cfu/头；c、f组在二免14天后分别用9型菌株进行攻毒，3×10⁹cfu/头，连续观察10天，观察记录仔猪发病和死亡情况，计算每组保护率，如表3所示。

表3猪链球菌gdzq株灭活疫苗对仔猪的交叉保护结果

表3结果显示，猪链球菌gdzq株灭活疫苗可对2、7、9型菌株的攻毒分别产生100％的交叉免疫保护。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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<110>广东海大畜牧兽医研究院有限公司，四川海林格生物制药有限公司

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