一种用于降低牛白血病易感性辅助选择的分子标记及应用的制作方法

本发明涉及cxcr1基因编码区980突变点作为分子标记的应用，属于分子生物学领域。

背景技术：

牛白血病是由牛白血病病毒(bovineleukosisvirus，blv)引起的一种牛慢性肿瘤性疾病，有多种病理类型，主要病理特征为淋巴样细胞恶性增生、进行性恶病质以及发病后的高死亡率^[1]。国际兽医局(oie)将之列为动物b类传染病，在我国进口动物检疫中属于二类传染病。根据其流行状况和疾病的表现形式可分为地方流行性牛白血病(enzooticbovineleukosis,ebl)和散发性牛白血病(sporadicbovineleukosis,sbl)

牛白血病病毒属c型致瘤病毒群、反转录病毒科(retroviridae)、致瘤病毒亚科(oncoviridae)的rna病毒^[2]。blv呈c型病毒粒子的典型形态^[3],blv粒子基本呈球型，直径80-120nm，芯髓直径60-90nm，芯髓由核芯和芯壳组成。病毒外部有双层囊膜，膜表面附有纤突，长约10-15nm，膜内含有丝状和点状结构。核衣壳呈20面体对称，没有感染性，呈螺旋状卷曲，中心是由两条35srna组成的倒置二聚体，能产生反转录酶(reversetranscriptase)，病毒粒子中的反转录酶分子量为70kd^[4]，与其他病毒的反转录酶需有锰离子才有最高活性不同，blv有镁离子存在时活性才最高^[5]。

blv粒子大约由60-70％的蛋白质，20-30％的类脂，2％的蔗糖，此外还含有1％的rna组成。由于迄今尚未发现分离株间有很大的差异^[6]，说明blv的遗传性比较稳定。blv的结构组成为：5'ltr-gag-pol-env-pxbl-3'ltr，为长末端重复序列，包括群特异性抗原基因(gag)、聚合基因(pol)、囊膜基因(env)，除基础结构外还含有tsx和rex两个辅助调控基因^[7]。

blv与其它有囊膜病毒一样，对外界环境的抵抗力不强，对去污剂等脂溶剂比较敏感，福尔马林、乙醚、铵离子等能迅速破坏其传染性。低ph、加热、干燥和非等渗的条件可使病毒失活。反复冻融、紫外线照射等多种方式均可杀灭该病毒。各种消毒药物能很快杀死病毒，杀死的最低浓度分别为苯酚2％、福尔马林4％、高锰酸钾0.02％、消毒灵0.01％、漂白粉05％、氢氧化钠1％、新洁尔灭0.05％等。

牛白血病病自然条件下主要以牛为感染对象，以4～8岁的牛发病为多，2岁以下的牛发病率很低。感染牛潜伏期平均为4年，大多呈无症状终生带毒。所有品种的牛均有易感性，且该病发病率随年龄增长而升高，奶牛发病率高于肉用牛。一般来说，ebl的发病高峰在6-8岁，一般测定公牛的感染率为10.4％，母牛为13.5％。感染牛中30％表现为持续性淋巴细胞增多症(pl)，可能发展至致死性淋巴肉瘤的概率仅有0.6％-5％。饲养管理不当、环境条件太差、营养不良及强应激都会使该病的发病率和死亡率明显增高。除此之外，过多摄入某些微量元素也会增加牛对blv诱癌的敏感性^[8]。

牛白血病的诊断方法有很多，可以进行病理学检查、血液学检查、电子显微镜检测、合胞体感染性测定、动物试验、血清学试验等。虽然该病的检测方法已经较为成熟，但是该病尚无特效疗法只能加以控制。想要达到对本病的控制平时应加强饲养管理，严格控制环境卫生等方面，再采取检疫、淘汰、隔离等综合性预防措施。

虽然牛白血病的控制技术国内外取了一些进展，但生产上收效并不理想，也没有对牛白血病易感性进行系统的选育。目前，奶牛群体牛白血病感染率仍维持较高水平，某些养牛国家牛白血病患病率高达60％。因此，急需一种能用于奶牛白血病辅助选择的分子标记及其检测方法，并结合传统的奶牛育种、人工授精等技术，从而降低我国奶牛白血病的感染率，提高奶牛养殖的终生产值和牛场的经济效益。

有研究表明趋化因子受体(chemokine(c-x-cmotif)receptor)及其配体在多种类型肿瘤组织中呈高表达的状态，影响肿瘤微环境，参与肿瘤细胞生存生长的调节、血管新生、侵袭及转移^[9-11]。对趋化因子受体家族在肿瘤中的深入研究不但能增加我们对肿瘤发病机制的认识，还有助于发展肿瘤治疗的新靶标。cxcr1作为趋化因子受体家族中的成员，研究显示其表达与数种肿瘤(比如乳腺癌^[12]，黑色素瘤^[13]，胰腺癌等)的生长、增殖、转移、侵袭、血管新生以及耐药性等有密切关系。而牛白血病与cxcr1基因是否有关联，尚未有的报道。如何通过育种选育奶牛白血病易感性低的品种仍是有待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于降低奶牛白血病易感性辅助选择的分子标记及应用。

本发明对奶牛大样本群体cxcr1基因编码区进行了测序，结合其牛白血病易感性等信息，筛选到一个与牛白血病易感性有显著相关的snp突变。本发明发现在cds区980bp处发现一个碱基g→a的突变(g980a)，导致蛋白质肽链中赖氨酸(lysine)突变为精氨酸(arginine)，并有3种基因型序(图1)，分别命名为aa、ga和gg基因型。以866头中国荷斯坦母牛为基础进行统计分析，aa、ga和gg型，基因型频率分别为0.60、0.353和0.047，优势基因为a，频率为0.78。该突变与牛白血病易感性显著相关。

基于此，本发明公开了cxcr1基因980位点作为降低牛白血病易感性辅助选择分子标记的应用。

本发明还公开了cxcr1基因980位点在奶牛育种中的应用。即在选育牛白血病低易感性的奶牛品系中的应用。

具体是：在奶牛育种中利用cxcr1基因g980a检测，筛选其中aa型个体公牛，并与其它母牛进行配种，增加其后代母牛cxcr1基因g980aaa和ga型个体比例。

利用本发明可以达到降低牛场牛白血病的发病率目的，同时可减少因淘汰奶牛而购买其他奶牛所产生的费用。

附图说明

图1是cxcr1-980g>a突变测序图。

图2是cxcr1-980aa基因型荧光定量检测图。

图3是cxcr1-980gg基因型荧光定量检测图。

图4是cxcr1-980ag基因型荧光定量检测图。

具体实施方式

实施例

(1)样品采集：从奶牛静脉采抗凝血10ml，分离血清，并用常规方法提取其dna；

(2)牛白血病检测

对分离出的血清样，用爱德士公司(idexx)市售牛白血病血清抗体x2检测试剂盒，根据产品说明书用酶联免疫法进行测定。

(3)cxcr1-980突变位点检测

根据genbank上公布的牛cxcr1基因mrna序列(ef597244)与牛基因组比对，找到5'侧翼区和编码区，用primer5.0软件设计引物(表1)。

表1cxcr1基因pcr扩增的引物序列、目的片段长度及退火温度

pcr扩增体系如下：总体积20μl，其中包括10×缓冲液2.0μl，25mmol/l镁离子1.5μl、taqdna聚合酶(5u/μl)0.3μl、dntp(10mmol/l)0.5μl，上下游引物各(10pmol/μl)1.0μl,模板dna(100ng/μl)1.0μl、ddh2o12.7μl。

pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃复性40s，72℃延伸10min，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。

对pcr产物，直接用abi9700型测序仪进行测序。对测序所得结果，用dnaman和chromas软件，与参考序列(登录号：ef597244)进行比对，并判定其基因型(图1)。

同时也可采用taqman探针法进行快速大批量检测，且价格便宜。采用taqman探针法对以上snp进行检测，方法如下：

使用软件primer5.0设计引物和探针，引物及探针序列如下：

上游引物：gccagaagtttcgccacg(seqidno.3)

下游引物：ctgaagaagagccaacaaagga(seqidno.4)

hp型探针：ctcctcaagatcatggc(seqidno.5)，用蓝色荧光fam标记

fp型探针：tcctcaggatcatggc(seqidno.6)，用绿色荧光hex标记

pcr体系如下：总体积20μl，其中包括2хhotstartfluo-pcrmix10μl，上下游引物各0.5μl，探针0.8μl，待测样品dna2.0μl，ddh2o6.2μl。

完成上述步骤后，把加好样品的384孔板放在lightcycler480softwaresetup(roche罗氏)荧光定量pcr仪进行反应。反应程序如下：初始步骤为95℃保存4min，然后进入热循环：95℃变性15秒，60℃退火/延伸60秒，共40个循环。

试验结束后对荧光定量检测结果进行分析，如图2-4所示，横坐标表示fam信号强度值，纵坐标表示vic信号强度值。图中每一个点代表一个个体，不同颜色和信号强度值的荧光代表其不同的基因型，因此点分布的密集程度表明不同基因型之间比例。图2和图3所示分别为fp型探针标记的aa基因型个体和hp型探针标记的gg基因型个体的分布图，二者荧光显色分别为蓝色和绿色。图4为杂合a/g基因型个体的分布图，荧光显色为红色荧光。

(4)通过logistic回归分析得出表2所示结果：

表2奶牛cxcr1位点不同基因型牛白血病感染情况对照表

具体实施方式

在全国各种公牛站进行常规奶牛育种工作中，增加本研究发现的分子标记筛选其中aa型个体公牛，并与母牛进行配种，可增加其后代母牛cxcr1基因g980aaa和ga型个体比例，逐渐淘汰gg型母牛个体。本发明首次披露了cxcr1基因g980a的snp突变位点的基因型在对奶牛白血病进行辅助选择方面的应用。相比于现有技术，本发明设计分子标记引物时使用的cxcr1基因与奶牛生产性能、免疫等性状密切相关，其snp突变标记点与奶牛白血病的感染显著相关，具有更高的准确性和可信度，因而可以有效地针对奶牛白血病的易感性对种牛进行辅助选择，以降低后代奶牛的发病率，并间接提高产值。

参考文献

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