基于eGFP的GPR120基因表达的检测方法及应用与流程

本发明属于egfp生物应用技术领域，具体涉及一种基于egfp的gpr120基因表达的检测方法，本发明还涉及一种基于egfp在gpr120基因表达检测中的应用。

背景技术：

gpr120(g-proteincoupledreceptor120；又名freefattyacidreceptor4，ffar4)是脂肪酸受体家族一员，属于g蛋白偶联受体(gpcr)，可被长链脂肪酸激活，尤以n-3不饱和脂肪酸激活能力最强。gpr120在脑、垂体、肺、舌、胃肠、脂肪组织等许多组织表达，主要分布于胃肠多种内分泌细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、成骨和破骨细胞以及味蕾细胞。gpr120激活可刺激glp-1、cck、gip等胃肠激素分泌，影响机体的内分泌代谢活动，与肥胖等代谢异常密切相关。

gpr120表达水平高低显著影响其细胞调节作用，gpr120表达调控的研究将促进对gpr120功能的认识和发现可能的代谢调节靶分子，为gpr120靶点药物的研发提供一定的依据。基因表达研究所常用技术手段目前有反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)和northern印迹杂交(northernblot)，这两种方法虽然技术成熟，广泛应用于基因表达水平的检测，但是也存在一定的缺点：一是实验过程较为繁琐，二是不能在活细胞水平监测基因表达的变化。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于egfp的gpr120基因表达水平的检测方法及其应用，解决了现有gpr120基因表达水平的检测中实验步骤繁琐、不能在活细胞水平监测基因表达的变化的问题，为gpr120基因表达水平的检测提供了新思路。

本发明所采用的技术方案是，egfp在gpr120基因表达水平的检测中的应用。

本发明的特征在于，

egfp与gpr120基因表达水平的呈线性关系，即随着egfp荧光平均强度值的增加，gpr120基因表达水平增加。

本发明所采用的另一个技术方案是，基于egfp的gpr120基因表达水平的检测方法：

步骤1，首先通过crispr/cas9技术将egfp片段定点插入到gpr120基因的终止密码子taa处，使egfp随gpr120表达而表达，获得egfp标记gpr120阳性细胞的转基因模型小鼠；

步骤2，随后应用荧光分析仪在488nm激光激发下对小鼠的阳性细胞荧光强度进行测定。

本发明的特征在于，

步骤2的荧光强度通过单细胞平均荧光强度进行表达。

步骤2的具体步骤：

步骤2.1，使用没有被egfp标定的小鼠细胞进行荧光分析仪的激光强度指标校正；

步骤2.2，收取步骤1中转基因模型小鼠的不同组织的egfp阳性细胞，通过经步骤2.1校正后的荧光分析仪进行荧光强度测定，获取egfp与gpr120基因表达水平之间的关系；同时通过rt-pcr方法检测egfp阳性细胞中gpr120的基因表达水平，验证egfp与gpr120基因表达水平之间的关系。

本发明有益效果是：

a)本发明通过实时监测gpr120基因表达，做到自身前后对照，控制组内误差，减少组间误差，保证测定结果更为可靠，从而弥补和克服了rt-pcr和northernblot等方法对不同组织细胞进行组间比较而产生的变异性、不能在活细胞水平监测基因表达的变化的问题；

b)本发明收取细胞后即刻确定gpr120基因表达水平，省去了rna提取、rna反转录和pcr等操作和反应过程，使gpr120基因表达检测更加简便快捷。

附图说明

图1是gpr120-ires-egfp转基因小鼠的组织细胞中egfp荧光阳性细胞，其中，图1a为gpr120-ires-egfp转基因小鼠组织在488nm激光激发下egfp荧光阳性细胞图，图1b为图1a的组织的普通光镜图，图1c为野生型小鼠组织在488nm激光激发下细胞图，图1d为图1c的组织的普通光镜图；

图2是小鼠组织中的扩增曲线图，其中，图2a为gpr120-ires-egfp转基因小鼠的组织中gpr120的rt-pcr小扩增曲线，图2b为gpr120-ires-egfp转基因小鼠的组织中egfp的rt-pcr小扩增曲线，图2c为野生型小鼠组织中gpr120的rt-pcr小扩增曲线，图2d为野生型小鼠组织中egfp的rt-pcr小扩增曲线；

图3是gpr120-ires-egfp转基因小鼠不同组织细胞中egfp荧光强度和gpr120基因表达水平之间的关系；

图4是gpr120-ires-egfp转基因小鼠腹腔巨噬细胞在体外经脂多糖处理后egfp荧光强度和gpr120基因表达水平之间的关系图，其中，图4a是gpr120基因表达水平在对照组和经脂多糖处理组的关系图，图4b是egfp荧光强度均值在对照组和经脂多糖处理组的关系图，图4c是gpr120基因表达水平与细胞egfp荧光强度均值的关系图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明以egfp标记gpr120阳性细胞的模型小鼠为对象，利用荧光显微镜技术测定小鼠egfp阳性细胞的荧光强度，与egfp阳性细胞的gpr120基因表达水平进行相关性分析，确定egfp阳性细胞的荧光强度与gpr120基因表达水平之间的线性关系，使egfp荧光强度作为gpr120基因表达水平的一个可靠的检测指标提供了依据。

基于egfp的gpr120基因表达水平的检测方法：

步骤1，首先通过crispr/cas9技术将egfp片段定点插入到gpr120基因的终止密码子taa处，使egfp随gpr120表达而表达，获得egfp标记gpr120阳性细胞的转基因模型小鼠，这样egfp随gpr120表达而表达，并且在mrna水平，egfp和gpr120相互分离，保证了gpr120蛋白的功能和代谢过程不受影响；

步骤2，随后应用荧光分析仪在488nm激光激发下对小鼠的阳性细胞荧光强度进行测定，并通过单细胞平均荧光强度表达，

步骤2.1，使用没有被egfp标定的小鼠细胞进行荧光分析仪的激光强度指标校正；

步骤2.2，收取步骤1中转基因模型小鼠的不同组织的egfp阳性细胞，通过经步骤2.1校正后的荧光分析仪进行荧光强度测定，获取egfp与gpr120基因表达水平之间的关系；同时通过rt-pcr方法检测egfp阳性细胞中gpr120的基因表达水平，验证egfp与gpr120基因表达水平之间的关系。

1.实验对象

制备的egfp标记gpr120的模型小鼠，细胞组织中能见egfp阳性细胞，在488nm激光激发下发出绿色荧光，具体如图1所示：图1a为gpr120-ires-egfp转基因小鼠组织的荧光阳性细胞图，可见阳性细胞，图1b为图1a的组织的普通光镜图，图1c为野生型小鼠组织的细胞图，未见荧光阳性细胞，图1d为图1c的组织的普通光镜图。

2.细胞内rna提取和反转录

在egfp标记gpr120的模型小鼠和野生型小鼠，分别提取小鼠的胃粘膜、十二指肠粘膜、空肠粘膜、结肠粘膜、脂肪组织、垂体、肺脏等组织器官的rna提取并进行反转录，具体如下：取上述组织各1-2mg，每样加入350μl裂解液rl，使用组织破裂仪破裂组织，再将所有溶液转移至过滤柱cs中以12000rpm速度离心2min，收集滤液；再向滤液中加入350μl70％的乙醇溶液，混匀后转入吸附柱cr3中以12000rpm速度离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，以12000rpm速度离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液，室温放置15min；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，以12000rpm速度离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，以12000rpm速度离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；重复向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室温静置2min，以12000rpm速度离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3置于室温放置5min以彻底晾干残余的漂洗液；将吸附柱cr3转入rnase-free离心管中，加入50μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，以12000rpm速度离心2min，得到rna溶液。

酶标仪检测rna浓度与纯度，琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。在八连管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer，再分别加入1μlgdnaeraser，再分别加入1μgtotalrna，最后用rnasefreedh2o补足至10μl，混匀，室温反应5min。在各管中分别加入以下试剂，4μl5xprimescriptbuffer2、4μlrnasefreedh2o、1μlprimescriptrtenzymemixi和1μlrtprimermix，总反应体系为20μl，混匀。反应条件为37℃、15min，85℃、5s。反应完成后将cdna存于4℃备用，长期保存时转入-20℃。

3.gpr120和egfp基因表达水平的检测

采用定量pcr方法对gpr120和egfp的基因表达进行检测。在八连管中依次加入6μldh2o，2μl模板cdna，2μlfas引物，10μlsybrpremixextaqii(2x)，总反应体系为20μl，混匀。

反应条件是：第一步是94℃、5min，第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min循环进行40次，第三步是加温溶解扩增产物，获得溶解曲线。

其中，总反应体系中小鼠gpr120引物序列是：

上游引物：5’-gtgccgggactggtcattgtg-3’；

下游引物：5’-ttgttgggacactcggatctgg-3’。

总反应体系中egfp引物序列是：

上游引物：5’-tcttcttcaaggacgacggcaact-3’；

下游引物：5’-ccttgatgccgttcttctgcttgt-3’。

以beta-actin基因表达为内对照，总反应体系中beta-actin引物序列是：

上游引物：5’-cgttggcatccacgaaacta-3’；

下游引物：5’-ggtgctgggaggtacaggg-3’。

对实验结果表达水平分析得到如图2所示的扩增曲线。如图2a表示转基因小鼠的组织中gpr120的rt-pcr小扩增曲线，如图2b表示转基因小鼠的组织中egfp的rt-pcr小扩增曲线，在一定阶段内两者均随着扩增循环次数的增大而升高。如图2c表示野生型小鼠组织中gpr120的rt-pcr小扩增曲线，在一定阶段内两者均随着扩增循环次数的增大而升高，如图2d表示野生型小鼠组织中egfp的rt-pcr小扩增曲线，曲线结果无表达。

以beta-actin基因表达为内对照，对各个不同组织中的gpr120基因表达水平进行分析，并应用荧光显微镜对各个组织中egfp标记的细胞的绿色荧光强度进行测量。结果表明，组织中gpr120表达水平与组织中绿色荧光细胞的荧光强度之间呈显著正相关，结果如图3所示。

实施例

培养egfp标记的gpr120的模型小鼠的肺泡巨噬细胞，具体方法如下：体外培养采用颈部脱臼法处死egfp标记gpr120的模型小鼠，用75％的酒精对小鼠进行消毒处理；用10ml注射器吸取pbs缓冲液6ml左右，除去气泡备用；用眼科剪剪开颈部至胸腔外表皮，分离颈部气管穿线备用，剪开胸腔使肺部暴露，用镊子夹住气管前端，剪短气管将注射器针尖插入气管并用线扎紧；缓慢注入pbs缓冲液2-3ml使肺部充满，吸出肺内溶液再缓慢注入，循环3-5次，吸取肺内pbs缓冲液注入离心管，所得为含肺巨噬细胞的溶液；将离心管配平于低温水平离心机离心6min，转速为1200rpm；吸去上清液，底物即为肺巨噬细胞。

向肺巨噬细胞中加入细胞培养液，充分混匀，种于培养皿，使每组培养皿内细胞数均匀，标上日期及名称，置37℃的co2培养箱中培养。培养8小时后，细胞分组，一组加入200ng/ml的脂多糖(lps)处理24小时，另外一组为对照组。

随后，应用荧光显微镜对各个组织中egfp标记的细胞的荧光强度进行测量，测量荧光强度之后，收集细胞的rna，反转录之后应用定量pcr方法观察gpr120基因表达水平。结果显示，如图4a所示，肺泡巨噬细胞的gpr120基因表达与lps处理组比较，对照组显著升高；如图4b所示，同时肺泡巨噬细胞的egfp荧光强度均值与lps处理组比较，对照组也显著升高；如图4c所示，gpr120基因表达与细胞egfp荧光强度均值之间存在显著正相关关系，随着egfp荧光强度均值的增大，gpr120基因表达水平升高。