一种O‑羧甲基‑N,N‑双链长烷基化壳寡糖及制备方法与应用与流程
本发明涉及一种o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖及制备方法与应用。
背景技术：
壳寡糖是安全无毒、可生物降解、并具有良好生物相容性的天然阳离子多糖，是聚合度低的壳聚糖，拥有壳聚糖的性质，并且相对于壳聚糖有更好的生物降解性、良好的水溶性等，在生物医用材料方面有广阔的应用前景。
纳米控释系统包括纳米粒子和纳米胶囊。它们是直径在10～500nm之间的固态胶态粒子，活性组成(药物、生物活性材料等)通过溶解、包裹作用位于粒子内部，或者通过吸附、附着作用于粒子表面。纳米级聚合物粒子作为药物传递和控释的载体，是一种新的药物控释系统。它与微米颗粒载体的主要区别是体积小，并且能够直接作用于细胞，因而作为新的药物载运系统被广泛应用。正是由于纳米控释系统特有的性质，使其在药物输送方面具有许多优越性。
囊泡是由双亲分子自组装形成的一种超分子聚集体，它们是由密闭双分子层所形成的球形的单腔室或多腔室的缔合结构，类似于细胞膜结构。根据囊泡结构的不同，可以分为单腔室囊泡、多腔室囊泡、多层囊泡。由于其结构的特殊性，经过多年发展，囊泡在医疗领域已经有了广泛的应用。现在囊泡已成为很多科学领域一种非常有用的研究工具，它在数学、理论物理，生物物理、化学、胶体科学、生物化学、生物学等学科中也得到了普遍的关注。卵磷脂等天然囊泡由小分子量的磷脂构成，稳定性较差，其应用受到一定限制。为了获得稳定性好、渗透性可控的囊泡，研究者越来越受到重视对聚合物囊泡的研究。聚合物囊泡由合成或天然改性的双亲性聚合物自组装构成。天然高分子具有独特的生物相容性等优点，由改性的双亲性天然高分子如壳聚糖来自组装囊泡在药物载体方面有是有良好的应用前景的，聚合物囊泡因为具有稳定性好、渗透性可控等优点而越来越受到重视，特别是在药物释放方面因此在这方面的研究已成为近来的研究热点。
传统的自组装纳米泡囊都是以壳聚糖为原料，制备壳聚糖衍生物，但壳聚糖的分子量大，制备的纳米泡囊体积大、个数少、产量低。壳寡糖是由壳聚糖解聚制成，其具有：分子量低、水溶性好、功能作用大、易被人体吸收、生物活性高等优势。壳聚糖的水溶性由脱乙酰度决定，容易将壳聚糖改性成为适于作为制备泡囊的双亲分子，而壳寡糖具有良好的水溶性，因而将壳寡糖作为制备泡囊的双亲分子的研究较少，所以需要提供适于制备泡囊的改性壳寡糖。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖，该壳寡糖既具有羧甲基，又具有疏水的长烷基侧链，使壳寡糖具备双亲性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖，其结构式为，
本发明的目的之二是提供一种o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的制备方法，能够使壳寡糖中的羟基羧甲基化，且具有疏水的长烷基侧链，使壳寡糖具备双亲性，该方法制备的壳寡糖不但具有抗菌性和保湿性，而且保持了壳寡糖原有良好的成膜性、生物相容性和生物降解等性能。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的制备方法，采用小分子醛类化合物对壳寡糖的氨基进行保护，再采用氯乙酸将氨基保护后的壳寡糖的c6位羟基进行羧甲基化反应，然后将保护氨基的保护基脱除得到o-羧甲基壳寡糖，最后采用长链脂肪醛将o-羧甲基壳寡糖上氨基的两个h进行烷基化反应即得o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖。
通过本发明的制备路径能够制备出o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖，首先，不但具有抗菌性和保湿性，而且保持了壳寡糖原有良好的成膜性、生物相容性和生物降解等性能。其次，该壳寡糖不仅具有羧甲基，还具有长烷基侧链，使其具有两亲性，从而为制备性能优良的泡囊提供基础。
本发明的目的之三是提供一种上述o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖在制备泡囊或药物缓释材料中的应用。
本发明的目的之四是提供一种泡囊，采用上述o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖自组织形成。该泡囊体积小于传统纳米泡囊，能穿过组织间隙并被细胞吸收。
本发明的目的之五是提供一种上述泡囊的制备方法，将上述o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖溶解于有机溶剂形成有机相，将药物溶解于水形成水相，将有机相与水相混合，在冰浴调节下超声振动形成油包水乳液(w/o乳液)，去除有机溶剂后超声振动即得囊泡。
本发明的目的之六是提供一种上述囊泡或上述o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖在药物载体领域中的应用。
本发明的有益效果为：
1)本发明制备的o-羧甲基-n,n-双长链烷基化壳寡糖是一种类似于卵磷脂的双亲性聚合物，它的结构具有亲水的壳寡糖骨架主链和羧甲基侧链以及疏水的长烷基侧链，不但具有抗菌性和保湿性，而且保持了壳寡糖原有良好的成膜性、生物相容性和生物降解等性能。
2)本发明制备的纳米泡囊体积小于传统纳米泡囊，具有超微小体积，能穿过组织间隙并被细胞吸收，可通过人体最小的毛细血管，还可通过血脑屏障。这些特有的性质使其在药物和基因输送方面具有许多优越性。
3)本发明制备的纳米泡囊，在相同实验条件下，相比于传统泡囊产量更高，且性能优异，载药量大，药物的释放速率高。
4)本发明制备的o-羧甲基-n,n-双长链烷基化壳寡糖自组装纳米泡囊稳定性好、渗透性可控、易降解、生物相容性高等优点，可作为药物缓释材料应用于人体，生物医学等领域具有广谱的应用价值。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为b12载药泡囊的体外药物释放曲线；
图2为胰岛素载药泡囊的体外药物释放曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中所述的小分子醛类化合物为主链碳数小于4的脂肪醛或侧链碳数小于3的苯甲醛，例如乙醛、丙醛、对甲氧基苯甲醛、苯甲醛、对硝基苯甲醛、间甲氧基对硝基苯甲醛
本发明中所述的长链脂肪醛为主链碳数为12～24的脂肪醛。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在壳寡糖不具备两亲性的不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖。
本申请的一种典型实施方式，提供了一种o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖，其结构式为，
本申请提供了一种o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的制备方法，采用小分子醛类化合物对壳寡糖的氨基进行保护，再采用氯乙酸将氨基保护后的壳寡糖的c6位羟基羧甲基化，然后将保护氨基的保护基脱除得到o-羧甲基壳寡糖，最后采用长链脂肪醛将o-羧甲基壳寡糖上氨基的两个h进行烷基化反应即得o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖。
通过本发明的制备路径能够制备出o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖，首先，不但具有抗菌性和保湿性，而且保持了壳寡糖原有良好的成膜性、生物相容性和生物降解等性能。其次，该壳寡糖不仅具有羧甲基，还具有长烷基侧链，使其具有两亲性，从而为制备性能优良的泡囊提供基础。
本申请提供一种优选的壳寡糖的氨基进行保护的方法，其步骤为，将壳寡糖制备成壳寡糖水溶液，将小分子醛类化合物溶于有机溶剂一中制备成醛溶液，将醛溶液加入至壳寡糖混合溶液，加热反应即可完成对壳寡糖氨基的保护。所述的有机溶剂一为既能够溶解小分子醛类化合物，又能够与水互溶的有机物，例如甲醇、乙醇、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)等。由于壳寡糖为水溶性大分子，一般小分子醛类化合物难溶于水，所以需要采用水与有机溶剂一进行混合，从而保证壳寡糖与小分子醛类化合物进行反应。
进一步优选的，加热至20～40℃，反应3～5h。
为了对氨基的保护壳寡糖进行提纯，本申请进一步优选的，采用乙醇对反应后的物料进行沉降、洗涤，然后进行抽滤、真空干燥。
优选的，所述壳寡糖的数均分子量为200～3000，脱乙酰度为80％～95％，进一步优选的脱乙酰度为90％～95％。
优选的，所述小分子醛类化合物的加入量为：小分子醛类化合物中醛基与壳寡糖中氨基的摩尔比为(3:1)～(1:1)，进一步优选为(3:1)～(2:1)。
优选的，所述羧甲基化反应的步骤为，将氨基保护后的壳寡糖置于异丙醇中在常温调节下进行溶胀，再置于冰盐浴中进行冷却，然后滴加naoh溶液，继续溶胀一段时间，溶胀结束后滴加氯乙酸的异丙醇溶液，加热进行羧甲基化反应，至形成均一溶液。由于进行氨基保护后的壳寡糖的溶解性较差，采用上述步骤后会使壳寡糖中的所有的c6位羟基均进行羟甲基化反应，从而提高了羟甲基化反应的效率。
进一步优选的，所述naoh溶液中naoh的浓度为50％(质量)。
进一步优选的，所述羟甲基化反应的反应温度为50℃，反应时间为4～6h。
为了将羟甲基化反应后的壳寡糖提取出来，进一步优选的，将羟甲基化反应后的溶液调节ph至中性，用4倍体积乙醇沉降，再依次进行抽滤、洗涤、真空干燥，其中所述洗涤，采用80～100％(体积)的乙醇洗涤3次。
优选的，所述氯乙酸的加入量为：氯乙酸的羧酸基团与壳寡糖的c6位羟基基团的摩尔比为2:1。
本申请优选的一种将保护氨基的保护基脱除的方法为，将羧甲基化反应后的壳寡糖溶于盐酸的乙醇溶液中，反应一段时间即到o-羧甲基壳寡糖。
进一步优选的，羧甲基化反应后的壳寡糖与氯化氢比为160:3(g:mol)。
为了将o-羧甲基壳寡糖提取出来，进一步优选的，采用丙酮沉淀，抽滤，丙酮洗涤3次以上，真空干燥。
本申请优选了一种o-羧甲基壳寡糖制备o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的方法，将o-羧甲基壳寡糖溶于去离子水中，加入长链脂肪醛和相转移催化剂，加热反应后，加入nabh4溶液，继续反应一段时间；反应后再次加入长链脂肪醛和相转移催化剂，进行反应，反应后再加入nabh4溶液，继续反应一段时间即的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖。
进一步优选的，反应温度为45℃，加入长链脂肪醛和相转移催化剂后的反应时间为4h，加入nabh4溶液后的反应时间为2～3h。
进一步优选的，第一次加入的长链脂肪醛与o-羧甲基壳寡糖的氨基摩尔比为4:1，第二次加入的脂肪醛与o-羧甲基壳寡糖的氨基摩尔比为2:1。
进一步优选的，第一次加入硼氢化钠的量为第一次加入的长链脂肪醛的摩尔量的2倍，第二次加入硼氢化钠的量为第二次加入的长链脂肪醛的摩尔量的2倍。
进一步优选的，所述相转移催化剂为与加入长链脂肪醛上碳的个数相等的烷基磺酸钠，加入的质量为第一次加入长链脂肪醛质量的1～2％。
为了将制备的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖提取出来，进一步优选的，先采用乙醇进行沉降，抽滤，再依次采用90％(体积)、95％(体积)、100％(体积)的乙醇洗涤，至ph值为中性，真空干燥烘至恒重。
本发明的工艺路线为：
其中，
本发明的目的之二是提供一种上述方法制备的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖。
本发明的目的之三是提供一种上述o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖在制备泡囊或药物缓释材料中的应用。
本发明的目的之四是提供一种泡囊，采用上述o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖自组织形成。该泡囊体积小于传统纳米泡囊，能穿过组织间隙并被细胞吸收。
本发明的目的之五是提供一种上述泡囊的制备方法，将上述o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖溶解于有机溶剂二形成有机相，将药物溶解于水形成水相，将有机相与水相混合，在冰浴调节下超声振动形成油包水乳液(w/o乳液)，去除有机溶剂后超声振动即得囊泡。所述有机溶剂二为能够溶解o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖，且不能与水互溶的有机物，如氯仿等。
优选的，所述有机相与水相的体积比为3:1。
优选的，制备的泡囊的直径为20～70nm。
本申请所述的药物为具有一定水溶性的药物，其溶解度为每100ml水溶解0.1～5g。
本发明的目的之六是提供一种上述囊泡或上述o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖在药物载体领域中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
实施例1
(1)n-苯亚甲基壳寡糖的合成
5g的壳寡糖溶于100ml去离子水中，室温下搅拌充分溶解后加入10ml无水乙醇，称取6.58g苯甲醛溶于10ml无水乙醇后加入到上述溶液中，搅拌，30℃反应4h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤二次，抽滤，真空干燥，得到n-苯亚甲基壳寡糖。
(2)o-羧甲基-n-苯亚甲基壳寡糖的合成
称取4g的(1)中干燥后的产品于20ml异丙醇中常温溶胀1h后置于冰盐浴中冷却2h，缓慢滴加50％的naoh溶液30ml，搅拌均匀，在冰盐浴中继续溶胀2h，缓慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的异丙醇溶液。50℃下水浴搅拌4h以上至形成均相溶液，10％的盐酸调ph至中性，4倍体积乙醇沉降，抽滤，用80％、90％、100％的乙醇各洗涤1次，真空干燥至恒重。
(3)o-羧甲基壳寡糖的合成
称取4g的(2)中干燥后的产品溶于150ml0.5mol/l的盐酸/乙醇溶液，搅拌反应12h。4倍体积丙酮沉淀，抽滤，丙酮洗涤3次以上，真空干燥至恒重。
(4)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖的合成
称取2g(3)中干燥后的产品溶于50ml去离子水中，加入6.73g月桂醛和0.13g十二烷基磺酸钠45℃搅拌4h，缓慢加入4.6gnabh4的水溶液，继续加热搅拌2小时。重复上述操作，再次加入3.36g月桂醛和2.3gnabh4的水溶液。4倍体积乙醇沉降，抽滤，依次用90％、95％、100％的乙醇洗涤3次，至ph值为中性，50℃真空干燥烘至恒重。
(5)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖自组装纳米泡囊的合成
将24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的氯仿溶液与8ml含4mg/ml维生素b12的水溶液混合，冰浴超声形成w/o乳液，减压蒸发除去有机溶剂至半固体胶状。在真空干燥器室温放置过夜，进一步除去剩余的氯仿。在超声波仪中超声3min即得泡囊，其平均直径为27.9nm。所得的泡囊用冷冻离心机分离，除去未包封的药物。记为样品1。
实施例2
(1)n-苯亚甲基壳寡糖的合成
5g的壳寡糖溶于100ml去离子水中，室温下搅拌充分溶解后加入10ml无水乙醇，称取6.58g苯甲醛溶于10ml无水乙醇后加入到上述溶液中，搅拌，30℃反应4h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤二次，抽滤，真空干燥，得到n-苯亚甲基壳寡糖。
(2)o-羧甲基-n-苯亚甲基壳寡糖的合成
称取4g的(1)中干燥后的产品于20ml异丙醇中常温溶胀1h后置于冰盐浴中冷却1h，缓慢滴加50％的naoh溶液30ml，搅拌均匀，在冰盐浴中继续溶胀2h，缓慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的异丙醇溶液。50℃下水浴搅拌4h以上至形成均相溶液，10％的盐酸调ph至中性，4倍体积乙醇沉降，抽滤，用80％、90％、100％的乙醇各洗涤1次，真空干燥至恒重。
(3)o-羧甲基壳寡糖的合成
称取4g的(2)中干燥后的产品溶于150ml0.5mol/l的盐酸/乙醇溶液，搅拌反应12h。4倍体积丙酮沉淀，抽滤，丙酮洗涤3次以上，真空干燥至恒重。
(4)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖的合成
称取2g(3)中干燥后的产品溶于50ml去离子水中，加入7.68g十四醛和0.15g十四烷基磺酸钠45℃搅拌4h，缓慢加入4.6gnabh4的水溶液，继续加热搅拌2小时。重复上述操作，再次加入3.84g十四醛和2.3gnabh4的水溶液。4倍体积乙醇沉降，抽滤，依次用90％、95％、100％的乙醇洗涤3次，至ph值为中性，50℃真空干燥烘至恒重。
(5)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖自组装纳米泡囊的合成
将24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的氯仿溶液与8ml含4mg/ml维生素b12的水溶液混合，冰浴超声形成w/o乳液，减压蒸发除去有机溶剂至半固体胶状。在真空干燥器室温放置过夜，进一步除去剩余的氯仿。在超声波仪中超声3min即得泡囊，其平均直径为42.4nm。所得的泡囊用冷冻离心机分离，除去未包封的药物。记为样品2。
实施例3
(1)n-苯亚甲基壳寡糖的合成
5g的壳寡糖溶于100ml去离子水中，室温下搅拌充分溶解后加入10ml无水乙醇，称取6.91g苯甲醛溶于10ml无水乙醇后加入到上述溶液中，搅拌，20℃反应4h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤二次，抽滤，真空干燥，得到n-苯亚甲基壳寡糖。
(2)o-羧甲基-n-苯亚甲基壳寡糖的合成
称取4g的(1)中干燥后的产品于20ml异丙醇中常温溶胀1h后置于冰盐浴中冷却2h，缓慢滴加50％的naoh溶液30ml，搅拌均匀，在冰盐浴中继续溶胀2h，缓慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的异丙醇溶液。50℃下水浴搅拌4h以上至形成均相溶液，10％的盐酸调ph至中性，4倍体积乙醇沉降，抽滤，用80％、90％、100％的乙醇各洗涤1次，真空干燥至恒重。
(3)o-羧甲基壳寡糖的合成
称取4g的(2)中干燥后的产品溶于150ml0.5mol/l的盐酸/乙醇溶液，搅拌反应12h。4倍体积丙酮沉淀，抽滤，丙酮洗涤3次以上，真空干燥。
(4)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖的合成称取2g(3)中干燥后的产品溶于50ml去离子水中，加入8.77g十六醛和0.17g十六烷基磺酸钠45℃搅拌4h，缓慢加入4.6gnabh4的水溶液，继续加热搅拌2小时。重复上述操作，再次加入4.38g十六醛和2.3gnabh4的水溶液。4倍体积乙醇沉降，抽滤，依次用90％、95％、100％的乙醇洗涤3次，至ph值为中性，50℃真空干燥烘至恒重。
(5)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖自组装纳米泡囊的合成
将24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的氯仿溶液与8ml含4mg/ml维生素b12的水溶液混合，冰浴超声形成w/o乳液，减压蒸发除去有机溶剂至半固体胶状。在真空干燥器室温放置过夜，进一步除去剩余的氯仿。在超声波仪中超声3min即得泡囊，其平均直径为64.5nm。所得的泡囊用冷冻离心机分离，除去未包封的药物。记为样品3。
实施例4
(1)n-苯亚甲基壳寡糖的合成
5g的壳寡糖溶于100ml去离子水中，室温下搅拌充分溶解后加入10ml无水乙醇，称取6.62g苯甲醛溶于10ml无水乙醇后加入到上述溶液中，搅拌，30℃反应4h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤二次，抽滤，真空干燥，得到n-苯亚甲基壳寡糖。
(2)o-羧甲基-n-苯亚甲基壳寡糖的合成
称取4g的(1)中干燥后的产品于20ml异丙醇中常温溶胀1h后置于冰盐浴中冷却2h，缓慢滴加50％的naoh溶液30ml，搅拌均匀，在冰盐浴中继续溶胀2h，缓慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的异丙醇溶液。50℃下水浴搅拌4h以上至形成均相溶液，10％的盐酸调ph至中性，4倍体积乙醇沉降，抽滤，用80％、90％、100％的乙醇各洗涤1次，真空干燥至恒重。
(3)o-羧甲基壳寡糖的合成称取4g的(2)中干燥后的产品溶于150ml0.5mol/l的盐酸/乙醇溶液，搅拌反应12h。4倍体积丙酮沉淀，抽滤，丙酮洗涤3次以上，真空干燥。
(4)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖的合成
称取2g(3)中干燥后的产品溶于50ml去离子水中，加入6.73g月桂醛和0.13g十二烷基磺酸钠45℃搅拌4h，缓慢加入4.6gnabh4水溶液，继续加热搅拌2小时。重复上述操作，再次加入3.36g月桂醛和2.3gnabh4水溶液。4倍体积乙醇沉降，抽滤，依次用90％、95％、100％的乙醇洗涤3次，至ph值为中性，50℃真空干燥烘至恒重。
(5)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖自组装纳米泡囊的合成
将24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的氯仿溶液与8ml含4mg/ml胰岛素的水溶液混合，冰浴超声形成w/o乳液，减压蒸发除去有机溶剂至半固体胶状。在真空干燥器室温放置过夜，进一步除去剩余的氯仿。在超声波仪中超声3min即得泡囊，其平均直径为31.3nm。所得的泡囊用冷冻离心机分离，除去未包封的药物。记为样品4。
实施例5
(1)n-苯亚甲基壳寡糖的合成
5g的壳寡糖溶于100ml去离子水中，室温下搅拌充分溶解后加入10ml无水乙醇，称取6.64g苯甲醛溶于10ml无水乙醇后加入到上述溶液中，搅拌，40℃反应4h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤二次，抽滤，真空干燥，得到n-苯亚甲基壳寡糖。
(2)o-羧甲基-n-苯亚甲基壳寡糖的合成
称取4g的(1)中干燥后的产品于20ml异丙醇中常温溶胀1h后置于冰盐浴中冷却1h，缓慢滴加50％的naoh溶液30ml，搅拌均匀，在冰盐浴中继续溶胀2h，缓慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的异丙醇溶液。50℃下水浴搅拌4h以上至形成均相溶液，10％的盐酸调ph至中性，4倍体积乙醇沉降，抽滤，用80％、90％、100％的乙醇各洗涤1次，真空干燥至恒重。
(3)o-羧甲基壳寡糖的合成
称取4g的(2)中干燥后的产品溶于150ml0.5mol/l的盐酸/乙醇溶液，搅拌反应12h。4倍体积丙酮沉淀，抽滤，丙酮洗涤3次以上，真空干燥。
(4)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖的合成
称取2g(3)中干燥后的产品溶于50ml去离子水中，加入7.68g十四醛和0.15g十四烷基磺酸钠45℃搅拌4h，缓慢加入4.6gnabh4水溶液，继续加热搅拌2小时。重复上述操作，再次加入3.84g十四醛和2.3gnabh4水溶液。4倍体积乙醇沉降，抽滤，依次用90％、95％、100％的乙醇洗涤3次，至ph值为中性，50℃真空干燥烘至恒重。
(5)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖自组装纳米泡囊的合成
将24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的氯仿溶液与8ml含4mg/ml胰岛素的水溶液混合，冰浴超声形成w/o乳液，减压蒸发除去有机溶剂至半固体胶状。在真空干燥器室温放置过夜，进一步除去剩余的氯仿。在超声波仪中超声3min即得泡囊，其平均直径为46.6nm。所得的泡囊用冷冻离心机分离，除去未包封的药物。记为样品5。
实施例6
(1)n-苯亚甲基壳寡糖的合成
5g的壳寡糖溶于100ml去离子水中，室温下搅拌充分溶解后加入10ml无水乙醇，称取6.58g苯甲醛溶于10ml无水乙醇后加入到上述溶液中，搅拌，30℃反应4h。4倍体积乙醇沉降，乙醇洗涤二次，抽滤，真空干燥，得到n-苯亚甲基壳寡糖。
(2)o-羧甲基-n-苯亚甲基壳寡糖的合成
称取4g的(1)中干燥后的产品于20ml异丙醇中常温溶胀1h后置于冰盐浴中冷却2h，缓慢滴加50％的naoh溶液30ml，搅拌均匀，在冰盐浴中继续溶胀2h，缓慢滴加5ml含有3.23g氯乙酸的异丙醇溶液。50℃下水浴搅拌4h以上至形成均相溶液，10％的盐酸调ph至中性，4倍体积乙醇沉降，抽滤，用80％、90％、100％的乙醇各洗涤1次，真空干燥至恒重。
(3)o-羧甲基壳寡糖的合成
称取4g的(2)中干燥后的产品溶于150ml0.5mol/l的盐酸/乙醇溶液，搅拌反应12h。4倍体积丙酮沉淀，抽滤，丙酮洗涤3次以上，真空干燥。
(4)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖的合成
称取2g(3)中干燥后的产品溶于50ml去离子水中，加入8.77g十六醛和0.17g十六烷基磺酸钠45℃搅拌4h，缓慢加入4.6gnabh4水溶液，继续加热搅拌2小时。重复上述操作，再次加入4.38g十六醛和2.3gnabh4水溶液。4倍体积乙醇沉降，抽滤，依次用90％、95％、100％的乙醇洗涤3次，至ph值为中性，50℃真空干燥烘至恒重。
(5)o-羧甲基-n，n-双链长烷基化壳寡糖自组装纳米泡囊的合成
将24ml含0.2mol/l的o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖的氯仿溶液与8ml含4mg/ml胰岛素的水溶液混合，冰浴超声形成w/o乳液，减压蒸发除去有机溶剂至半固体胶状。在真空干燥器室温放置过夜，进一步除去剩余的氯仿。在超声波仪中超声3min即得泡囊，其平均直径为66.7nm。所得的泡囊用冷冻离心机分离，除去未包封的药物。记为样品6。
对比例1
本实施例与实施例1相同，不同之处在于，采用分子量30万、脱乙酰度90％的壳聚糖制备成o-羧甲基-n，n-十二烷基化壳聚糖纳米泡囊，其中溶剂为1％的乙酸水溶液。记为对比样品1。
对比例2
本实施例与实施例4相同，不同之处在于，采用分子量30万、脱乙酰度90％的壳聚糖制备成o-羧甲基-n，n-十二烷基化壳聚糖纳米泡囊，其中溶剂为1％的乙酸水溶液。记为对比样品2。
b12载药泡囊的体外药物释放测定
实验方法：取一定量的b12载药泡囊放入透析袋中，置于ph＝7的0.2mol/l磷酸盐缓冲溶液中。每隔一定的时间取出2ml透析液，再补充2ml的新鲜缓冲溶液。取出的溶液经分光光度计在361nm波长下测定吸光度。根据b12的浓度—吸光度关系曲线确定药物释放量，据此数据绘制b12载药泡囊的释放量和时间的关系曲线，如图1。
由图1中数据可知，壳寡糖基载药泡囊的体外药物释放比壳聚糖基载药泡囊的体外药物释放量大大提高。壳聚糖基泡囊的药物释放速率较低，达到平衡的释放百分率也较小，这与其微囊的结构较为紧密有关。而壳寡糖基泡囊正是弥补了这一不足，从而大大提高了药物释放速率。相比样品1-3，随着脂肪醛基链长的增加器药物释放速率也有略微降低，这是因为脂肪醛在取代过程中，随着链长的增加其空间位阻增大，使其取代度降低，导致药物释放量和释放速率略有降低。由于囊泡是由双亲分子自组装形成的一种超分子聚集体，它们是由密闭双分子层所形成的球形的单腔室或多腔室的缔合结构，类似于细胞膜结构，所以其脂肪醛的链长也不能太短，太短会无法形成密闭的双分子层。实验结果显示o-羧甲基-n,n-十二烷基化壳寡糖纳米泡囊的药物缓释效果最好。
胰岛素泡囊的体外药物释放测定
实验方法：胰岛素载药泡囊的体外释放测定于0.2mol/l的磷酸缓冲溶液中进行。取一定量的胰岛素载药泡囊放入透析袋中，置于磷酸缓冲溶液中。每隔一定的时间取出0.2ml缓冲液，再补充0.2ml的新鲜缓冲溶液。取出的溶液用0.2mol/l的醋酸/醋酸钠缓冲溶液(ph3.6)稀释至3.2ml，再经紫外-可见分光光度计在226nm波长下测定吸光度。根据胰岛素的浓度-吸光度关系曲线确定药物的浓度，据此数据绘制泡囊中胰岛素的释放量和时间的关系曲线，如图2。
由图2中数据可知，壳寡糖基胰岛素载药泡囊的体外药物释放比壳聚糖基胰岛素载药泡囊的体外药物释放量大大提高。相比壳聚糖基胰岛素载药泡囊，壳寡糖基胰岛素载药泡囊的释放有一定的规律，易于掌控。由于o-羧甲基-n,n-双链长烷基化壳寡糖纳米泡囊较小，在体内更容易降解，不会对人体带来伤害。
此外，胰岛素的释放速率比b12稍低，持续释放时间为48小时以上，而b12仅为24小时左右。这些性质对胰岛素载药泡囊的实际应用非常有利。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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