本发明属于兽医免疫学技术领域，具体涉及一种鸡新城疫诊断抗原的制备方法。
背景技术：
新城疫(newcastledisease,nd)是由新城疫病毒(ndv)引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。病鸡是本病的主要传染源，鸡感染后就出现临床症状是：呼吸困难，拉绿色稀便，精神沉郁，个别出现转圈的神经症状。病毒从口、鼻分泌物和粪便排出。病毒存在于病鸡所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。在流行间歇期带毒鸡，也是本病的传染源。鸟类也是重要的传播者。病毒可经消化道、呼吸道，也可经眼结膜、受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体。该病一年四季均可发生，但以春秋季较多。鸡场的鸡群一旦发生本病，可于4-5天内波及全群。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病之一。世界动物卫生组织(oie)将其列为a类疫病。我国列入重大传染病，也是禽类重点防控的传染病之一。
目前鸡城新城的防控主要是：⑴采取分子生物学方法和免疫学方法进行流行病学调查，得到早发现、早诊断、早治疗，将易感鸡提前扑杀，控制易感鸡群感染；⑵新城疫疫苗预防，我国已将新城疫的免疫列入各养鸡场的免疫程序。免疫学方法血清凝集试验和血清凝集抑制试验快速、简便诊断疾病，易于基层兽医站工作人员和鸡场化验员掌握，这就需要新城疫快速诊断抗原，提供一种新城疫诊断抗原的制备方法是目前需要解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的是利用制备的抗原，对各养鸡场鸡群进行鸡新城疫疫免抗体的检测，达到减少发病，提高鸡场经济效益的目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种鸡新城疫诊断抗原的制备方法，包括以下步骤：
第一步，ndv分离鉴定：无菌采集疑似鸡新城疫病的死鸡病料；鸡胚繁殖；rt-pcr扩增，证明为ndv山西株；
第二步，诊断抗原的制备：将分离鉴定的ndv在鸡胚中大量繁殖，收获得鸡胚尿囊液保存备用；检测病毒效价：用血凝试验方法检测病毒效价，病毒效价达到26为合格；检测病毒凝集价：病毒凝集价达到10log2为合格；诊断抗原浓缩；诊断抗原灭活；诊断抗原效价测定，即为诊断抗原。
本发明诊断抗原原理分析：
(1)浓缩透吸袋的功效：透吸袋是由聚脂纤维制成的，经过反复试验，此透吸袋装水后容易被蔗糖将透吸袋里的水份吸出，这样既经济又实惠，可以提高病毒浓度。
(2)浓缩蔗糖的功效：蔗糖除了有一般化学试剂的功效，还有吸水性很强功能，而且市场上容易购买，价格便宜。
(3)浓缩病毒尿囊液的作用：ndv在鸡胚中繁殖收获的尿囊液中水份所占的比例大，经过浓缩，将多余的水份去掉，病毒含量提高，对nd检测更加准确。
本发明用透吸袋和蔗糖浓缩抗原，经多年应用检测效果达到95％以上。首先是对鸡群进行流行病学调查，降低新城疫病的发生和流行，增加养鸡场的经济效益；其次是对鸡场免疫前后的鸡群进行抗体检测，为鸡场制定科学的免疫程序。
与现有的milliporepellicon超滤、peg6000沉淀、蔗糖-甘油垫等方法浓缩技术相比，本发明既经济又方便。不用花大量资金购买昂贵的仪器，本发明适合于各养鸡场和基层兽医站应用，经多年的试验浓缩的诊断抗原检测达到95％以上，应用效果颇佳。
具体实施方式
本实施例一种鸡新城疫诊断抗原的制备方法，包括以下步骤：
第一步，ndv分离鉴定：无菌采集疑似鸡新城疫病的死鸡病料；鸡胚繁殖；rt-pcr扩增，证明为ndv山西株；
第二步，诊断抗原的制备：将分离鉴定的ndv在鸡胚中大量繁殖，收获得鸡胚尿囊液保存备用；检测病毒效价：用血凝试验方法检测病毒效价，病毒效价达到26为合格；检测病毒凝集价：病毒凝集价达到10log2为合格；诊断抗原浓缩；诊断抗原灭活；诊断抗原效价测定，即为诊断抗原。
本发明用制备的诊断抗原，对鸡群进行nd流行病学调查和免疫前后抗体效价的检测，为鸡场的防控提供有力依据。诊断抗原的制备主要试剂和材料是：鸡胚、新城疫病毒rt-pcr检测试剂盒、蔗糖和聚脂纤维透吸袋、医用止血钳、糖瓷白盘等。具体实施方式如下：
1、分离鉴定
(1)nd乳液制备：从山西省不同地区鸡场无菌采集疑似鸡新城疫病的病死鸡心、肝、脾等病料，经研磨制成乳液。
(2)rt-pcr扩增：使用新城疫病毒rt-pcr检测试剂盒进行扩增，结果可见被检样本与阳性对照出现同一位置的明显条带，证明有ndv。
(3)鸡胚繁殖：无菌制备的乳液，稀释后接种11日龄鸡胚，盲传几代，收集尿囊液进行血凝试验检测病毒效价达到26为合格。
2、诊断抗原制备方法
⑴ndv感作反应：取分离鉴定的ndv作10倍稀释，为了抑制杂菌，可加入5000单位的青霉素进行感作反应。
⑵鸡胚繁殖：购买spf鸡蛋60枚，用消毒水洗净凉干，放入37度、湿度65％的孵化机孵育，每天翻两次蛋，孵育5-6日去除死胚和白蛋，11日龄接种分离鉴定的ndv，每枚接种0.2/ml，继续孵育，每天观察鸡胚发育情报况，24小时以内死亡的鸡胚弃掉，24-120h死、活鸡胚从孵化机里取出放入4℃冰箱保存，收获鸡胚尿囊液。
⑶检测病毒效价：用血凝试验方法检测病毒效价，病毒效价达到26为合格。
⑷检测病毒凝集价：nd标准阳性血清从中国兽医药品监察所购买，分离的诊断抗原作4倍和8倍稀释，用血凝抑制试验方法检测病毒的凝集价，病毒凝集价达到10log2为合格。
⑸诊断抗原浓缩：①主要材料：聚脂纤维透吸袋(简称透吸袋)、蔗糖(分析纯)、医用止血钳、糖瓷白盘、鸡胚繁殖病毒尿囊液；②浓缩方法：取鸡胚繁殖病毒尿囊液50ml加入透吸袋里，透吸袋两头用医用止血钳挟住；500克蔗糖(分析纯)倒入糖瓷白盘里铺开；将装有50ml病毒尿囊液透吸袋放入倒有蔗糖的糖瓷盘里，蔗糖将装有50ml病毒尿囊液透吸袋里的水份慢慢吸出，大约透吸袋里的病毒尿囊液有10-15ml即可停止浓缩；用试管将透吸袋里的病毒尿囊液吸入无菌瓶里，-20℃冻存备用。
⑹诊断抗原灭活：灭活剂为福尔马林(分析纯)，浓缩的病毒用福尔马林灭活，100ml病毒液里加入0.2ml福尔马林，摇匀备用。
⑺诊断抗原效价测定：用血凝试验和血凝抑制试验对灭活病毒进行测定，血凝价为28；血凝抑制价为10log2，即为诊断抗原。
本发明诊断抗原的使用方法：使用自制的诊断抗原，对不同鸡群进行鸡新城病的流行病学调查和免疫抗体的检测，达到早发现、快速诊断、早治疗的目的，减少鸡场的经济损失。