一株柯萨奇B组5型病毒及其用于制备感染性动物模型及试剂盒的用途的制作方法

【技术领域】

本发明涉及病毒学。特别地，本发明涉及一株能感染乳鼠的柯萨奇b组5型病毒，以及该病毒的用途。

背景技术：

柯萨奇病毒b组5型(coxsackievirusb5,cv-b5)属于小核糖核酸病毒科(picornaviridae)，肠道病毒属(enterovirus)。cv-b5是无菌性脑膜炎的主要病原体之一。cv-b5感染除可引起上呼吸道感染、腹泻以及手足口病等，主要引起病毒性脑炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、弛缓性麻痹、扩张性心肌炎以及糖尿病等多种重症疾病。此外，根据文献报道，cv-b5感染可引起短暂性失语症和小儿急性横贯型脊髓炎等罕见临床症状。近年来在我国hfmd病例中检出较高比率的cv-b5感染，但相关基础研究较少。

动物模型是研究病毒在体内的入侵、复制、传导、致病、转归等机理以及评价疫苗预防效果和药物疗效等的重要工具。理想的动物模型对于致病机理、药物治疗效果以及疫苗相关研究均具有重要意义。有学者采用猪、c3h/hej小鼠和balb/c小鼠开展了cv-b5的动物模型相关研究，但目前国内外尚无系统的、与人体临床症状相近的cv-b5动物模型成功构建的报道，严重制约了相关基础研究的开展。

《柯萨奇b5病毒感染心肌细胞微量模型的建立》(沈茜等人，第二军医大学学报1989年第10卷低3期)公开了柯萨奇b5病毒感染的波动乳鼠心肌细胞微量模型，获得了体外心肌细胞病变效果，然而并没有涉及动物模型。

《柯萨奇病毒b组5型的研究进展》(郝晓甜等人，中国生物制品学杂志2017年4月第30卷第4期)提及现有的cv-b5毒株感染小鼠可引起胰腺炎，或引起间质性肺炎和心肌炎。

由此可见，尽管cv-b5病毒是无菌性脑膜炎的主要病原体之一，然而目前尚未能够建立有效获得脑部病变或脊髓神经病变的动物模型。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一株能够有效感染乳鼠并获得脑部病变及脊髓神经病变的柯萨奇b组5型病毒毒株，并提供该毒株在制备动物模型中的用途。

为了实现上述目的，本发明提供一株能稳定复制和传代的柯萨奇b组5型病毒(coxsackievirusbgroup5type)cvb5/js417，所述病毒于2017年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmccno.13851；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体地，以2013年收集的江苏地区手足口病例临床样本为研究对象，经vero细胞分离、纯化获得一株可稳定复制的病毒株，命名为cvb5/js417。所得毒株经全基因序列扩增后基因序列比对证实为cv-b5病毒，基因全长为7370bp。经外源因子检测，证实该病毒株无其他外源因子污染。经生物学特性分析，该病毒株病毒滴度为8.50lgccid50/ml。

本发明还提供上述柯萨奇b组5型病毒cvb5/js417在制备柯萨奇病毒b组5型感染小鼠中的用途。

分别采用相同剂量的cvb5/js417病毒，腹腔攻击1～3日龄的balb/c、c57、nih、icr和昆明鼠，结果实验动物在攻击后3天先后出现后肢麻痹、萎靡甚至死亡，其中balb/c、c57鼠均在攻击后21天内可导致70％～100％实验动物致死。

采用相同剂量cvb5/js417病毒株分别腹腔攻击新生1、3、5、7、14日龄的balb/c小鼠。cvb5/js417可使新生1～3日龄小鼠全部出现发病和死亡。

在感染方式方法，采用相同剂量的cvb5/js417病毒株，分别通过颅内、腹腔、口服方式感染3日龄balb/c乳鼠。三种感染方式的动物死亡率均为100％。

在感染剂量方面，分别采用0.50-7.50lgccid50/只的cvb5/js417腹腔攻击3日龄balb/c小鼠。其中，3.50～7.50lgccid50/只剂量组均可使实验动物出现100％发病和死亡。

由此可见，以cvb5/js417病毒株腹腔方式攻击3日龄balb/c小鼠能够建立cv-b5小鼠动物模型。该模型可导致实验动物出现精神萎靡、脱毛、颤抖、弓背、后肢麻痹和拖腿等症状，并最终导致100％的受攻击小鼠死亡。且该实验具有良好的重复性。

分别采集受攻击后的垂死实验动物，分别取脑、心、肝、肾、肺、脾、脊髓等组织进行病理检查以及免疫组织化学染色。结果攻毒小鼠在脑、脊髓、心肌和后肢骨骼肌处可见明显的嗜酸性变性坏死以及空泡变性坏死，同时免疫组织化学染色显示脑、脊髓神经细胞以及心肌、后肢骨骼肌细胞出现阳性或强阳性反应，证实cvb5/js417可导致受攻击小鼠脑部、脊髓神经、心肌和后肢骨骼肌都产生明显病变及坏死，这是现有技术中未曾发现的。

本发明还提供上述柯萨奇b组5型cvb5/js417病毒在制备柯萨奇病毒b组5型疫苗中的用途。

为了解cv-b5中和抗体的保护能力，将cv-b5中和抗体(>1：1024)分别用生理盐水从15～1215倍进行3倍系列稀释。应用本发明构建的乳鼠模型，在给予实验动物3.50lgccid50/只剂量病毒攻击后1小时内，分别用3倍稀释的cv-b5中和抗体和生理盐水对照，腹腔注射被攻击动物。结果生理盐水对照组在病毒感染后8d至10d间实验动物相继死亡，死亡率100％；而15倍和45倍抗体组动物的存活率均为100％；135倍、405倍和1215倍抗体组的动物存活率分别为66.7％、33.3％和0。显示cv-b5中和抗体可有效保护新生乳鼠免受致死剂量的cvb5/js417病毒攻击，且保护水平呈现良好的剂量效应关系。

在cv-b5抗原的免疫保护能力方面，采用灭活后cvb5/js417病毒从原倍到10,000倍系列稀释，将系列稀释后的cvb5/js417病毒与生理盐水对照分别免疫balb/c成年雌鼠各2只，免疫当天分别与雄鼠合笼令其交配，14天后分别加免一针，待雌鼠生产后3d，记录所生乳鼠健康状况，挑选健康状况良好的乳鼠分别采用3.50lgccid50/只剂量的cv-b5/js417病毒进行攻击。结果显示生理盐水对照组全部发病和死亡，而原倍、10倍、100倍、1000倍和10,000稀释组的动物存活率分别为100％、44％、30％、0和0，表明cvb5/js417灭活病毒可诱导机体产生剂量依赖型保护性抗体。

本发明还提供含有上述柯萨奇b组5型病毒cvb5/js417的试剂盒。

本发明的柯萨奇b组5型病毒(coxsackievirusbgroup5type)cvb5/js417于2017年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13851；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

【附图说明】

图1为不同品系小鼠被病毒株攻击后的存活率；

图2为不同感染日龄小鼠的存活率；

图3为不同感染方式的存活率；

图4为不同感染剂量的存活率；

图5为cvb5/js417病毒感染鼠的存活率；

图6为cvb5/js417病毒感染鼠的病理改变；

图7为cvb5/js417病毒感染鼠的免疫组织化学检查结果；

图8为cvb5/js417病毒中和抗体保护试验结果；

图9为cvb5/js417灭活病毒免疫保护试验结果。

【具体实施方式】

以下实施例用于非限制性的解释本发明的技术方案。

实施例1cvb5/js417病毒株的分离和建立

以2013年收集的江苏地区手足口病例临床样本为研究对象，经vero细胞分离、纯化获得一株可稳定复制的病毒株，命名为cvb5/js417，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13851。经全基因序列扩增后基因序列比对证实其为柯萨奇b组5型病毒(coxsackievirusbgroup5type)，基因全长为7370bp。经外源因子检测，证实该病毒株无其他外源因子污染。经生物学特性分析，该病毒株病毒滴度为8.50lgccid50/ml。

其中，病原体的采样、收集样本的细胞分离、纯化、基因序列扩增、外源因子检测和病毒滴度分析均采用本领域的常规操作进行。

实施例2cv-b5动物模型的建立

(1)动物品系的选择

分别采用相同剂量的cvb5/js417病毒，选择1～3日龄的balb/c、c57、nih、icr和昆明鼠进行腹腔感染，3天后实验动物先后出现后肢麻痹、萎靡甚至死亡。其中，balb/c、c57鼠组在感染6天后即有70％～100％的实验鼠致死。

考虑balb/c鼠为近交系小鼠，具有更相近的遗传背景，有利于实验一致性，故选择balb/c鼠建立cv-b5动物模型进一步实验。

(2)乳鼠日龄的选择

采用相同剂量cvb5/js417病毒株分别腹腔攻击新生1、3、5、7、14日龄的balb/c小鼠，观察其存活率。

如图2所示，cvb5/js417可使新生1～3日龄小鼠全部出现发病和死亡，发病和死亡时间随小鼠日龄的增长而延长；而对5日龄及其以上小鼠致死率明显下降，降低至50％及50％以下。可见，1～3日龄小鼠均适合作为动物模型，故选择3日龄乳鼠构建cv-b5感染模型做进一步实验。

(3)感染方式的选择

采用相同剂量的cvb5/js417病毒株分别通过颅内、腹腔、口服方式感染3日龄balb/c乳鼠。

如图3所示，三种感染方式的动物死亡率均可达到100％，可见这些感染方式均不同程度可使模型动物发病和死亡。

考虑口服和腹腔攻毒方式较颅内更接近于临床自然感染，而口服方式操作困难，不宜控制攻毒剂量，因此选择腹腔接种方式构建cv-b5感染模型作进一步实验。

(4)攻毒剂量的确定

分别采用0.50～7.50lgccid50/只剂量cvb5/js417腹腔攻击3日龄balb/c小鼠，观察其存活率。

结果如图4所示，腹腔攻击后2～12天，实验鼠相继出现发病和死亡，其中，3.50～7.50lgccid50剂量组均可使实验动物100％发病和死亡；而2.50lgccid50、1.50lgccid50和0.50lgccid50攻毒剂量组只能导致80％、28.5％和0％的实验动物死亡，由此可见cvb5/js417构建的小鼠模型具有良好的剂量效应关系。选择3.50lgccid50/只剂量进一步实验。

(5)cv-b5小鼠动物模型的建立

采用3.50lgccid50/只剂量cvb5/js417病毒株腹腔方式攻击3日龄balb/c小鼠建立cv-b5小鼠动物模型，并观察实验鼠的状态，记录实验鼠出现精神萎靡、脱毛、颤抖、弓背、后肢麻痹、拖腿，并最终死亡的时间。

在不同时间里重复相同实验六次，采用相同的条件，对比试验数据。结果显示，结果6次试验均可在攻毒后21日内导致100％的实验鼠动物出现临床症状并死亡。由此可见通过cvb5/js417病毒建立的cv-b5小鼠实验动物模型具有良好的重复性。

实施例3病理状况

根据实施例2第(4)节记载的方式建立cv-b5小鼠实验动物模型，分别收集攻击后的垂死实验鼠的脑、心、肝、肾、肺、脾、脊髓等组织进行病理检查以及免疫组织化学染色。

对照组以生理盐水按照与实验动物相同的试验方法、采集时间和检查方式获得。

病理检查采用组织固定、石蜡切片、病理he染色和免疫组织化学染色，并显微镜观察，依据正常新生小鼠组织切片以及阴性对照鼠组织切片判定结果。病理检查以免疫组织化学染色结果的判断均为本领域常规手段。

各组织病理结果如图6所示，在脑(表现在皮层与海马体等)、脊髓、心肌和后肢骨骼肌处可见明显的嗜酸性变性坏死以及空泡变性坏死，而对照组实验动物则未见任何病理改变。

免疫组织化学染色结果如图7所示，结果显示实验组在脑、脊髓神经细胞以及心肌、后肢骨骼肌细胞出现阳性或强阳性反应，而对照组表现为阴性，证实受攻击小鼠的脑部、脊髓、心肌和后肢骨骼肌存在大量cvb5病毒。

可见，cvb5/js417毒株构建的cv-b5小鼠实验动物模型有效获得了小鼠脑部、脊髓神经、心肌和后肢骨骼肌产生明显病变及坏死。

实施例4中和抗体保护试验

将cv-b5中和抗体(>1：1024)分别用生理盐水从15～1215倍进行3倍系列稀释后备用。所述中和抗体是通过常规操作方式，将灭活cv-b5/js417毒株分别于第0、3周时免疫balb/c小鼠，并于第4周采集鼠血，分离血清后制备得到的。

以实施例2的感染小鼠模型，在给予实验鼠动物3.50lgccid50/只剂量病毒攻击后1小时内，分别用3倍稀释的cv-b5中和抗体和生理盐水对照，腹腔注射被攻击动物，观察并记录。

结果如图8所示，对照组在病毒感染后8d至10d间实验动物相继死亡，死亡率100％。而15倍和45倍抗体组动物的存活率均为100％。135倍、405倍和1215倍抗体组的动物存活率分别为66.7％、33.3％和0。

由此可见，显示cv-b5中和抗体可有效保护新生乳鼠免受致死剂量的cvb5/js417病毒攻击，且保护水平呈现良好的剂量效应关系。

(2)母传抗体保护试验

应用实施例2获得的乳鼠模型，采用母传抗体保护模式，采用灭活后cv-b5病毒从原倍到10,000倍系列稀释，将系列稀释后的cvb5/js417病毒与生理盐水对照分别免疫balb/c成年雌鼠各2只，免疫当天分别与雄鼠合笼令其交配，14天后分别加免一针，待雌鼠生产后3d，记录所生乳鼠健康状况，挑选健康状况良好的乳鼠分别采用3.50lgccid50/只剂量的cv-b5病毒进行攻击，每天观察并记录乳鼠情况。

结果如图9所示，生理盐水对照组动物全部发病和死亡，而原倍、10倍、100倍、1000倍和10,000倍稀释的灭活cv-b5病毒组的动物存活率分别为100％、44％、30％、0和0。显示cv-b5灭活病毒可诱导机体产生剂量依赖型保护性抗体，为cv-b5疫苗的研发提供了宝贵的实验资料。

由此可见，本发明的cvb5/js417病毒及通过该毒株获得的cv-b5动物模型，具有病毒背景清晰、无外源因子污染、攻毒后实验动物临床症状清晰、典型，重复性好，同时具有良好的剂量依赖性。通过应用研究显示，主动免疫cv-b5灭活病毒和被动免疫高效价cv-b5中和抗体均可保护实验动物免受致死量病毒攻击，可用于今后cv-b5疫苗或药物的免疫保护或疗效研究。