一种高效扩增人骨髓间充质干细胞并保持其干性的培养基及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效扩增人骨髓间充质干细胞并保持其干性的培养基及方法，可明显提高干细胞扩增速率并能够在增殖过程中保持良好的干细胞干性。

背景技术：

骨髓间充质干细胞(bmscs)作为一种新的用途广泛的种子细胞，具有较强增殖能力和多向分化潜能，能够在特定诱导条件下向成骨细胞、成纤维细胞、网状细胞、脂肪细胞和内皮细胞等分化，可进行自体移植而不存在组织配型和免疫排斥，在细胞移植、基因治疗、细胞治疗和组织工程等领域具有广泛的应用前景[tissueengregenmed.2016；13:465-74]。

骨髓间充质干细胞在应用于临床治疗和组织工程中需要大量细胞，但从骨髓中获取的干细胞数量有限，不能满足实际应用所需的细胞量，同时干细胞在体外培养扩增过程中，极易分化、老化从而失去多向分化潜能，即干细胞的干性，因此本领域目前迫切需要研究骨髓间充质干细胞快速扩增并保持干性的方法，以满足科研及临床应用的需要。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种高效扩增人骨髓间充质干细胞(hbmsc)并保持其干性的培养基和方法。

一方面，本发明提供一种能够高效扩增人骨髓间充质干细胞并保持其干性的培养基，其含有si离子和sr离子中的至少一种，优选为含有si离子和sr离子，其中，si离子的浓度为1～10ppm，sr离子的浓度为2～50ppm。

使用本发明的培养基培养人骨髓间充质干细胞时，能提高骨髓间充质干细胞的扩增效率，同时保持良好的干细胞干性，可为科学研究及临床应用提供大量的骨髓间充质干细胞。例如，本发明的培养基促进hbmsc增殖百分比可为20％～50％。

较佳地，si离子的浓度为1.5～5ppm。

较佳地，sr离子的浓度为10.5～40ppm。

较佳地，所述培养基是人骨髓间充质干细胞专用完全培养基对casio3粉体的浸提液、人骨髓间充质干细胞专用完全培养基对sro粉体的浸提液、人骨髓间充质干细胞专用完全培养基对srsio3粉体的浸提液、或其中任意两种以上的混合。

另一方面，本发明提供一种高效扩增人骨髓间充质干细胞并保持其干性的方法，用上述任意一种培养基培养人骨髓间充质干细胞。

根据上述方法，可以高效扩增人骨髓间充质干细胞并保持其干性，可以短时间内获得大量具有良好干性的骨髓间充质干细胞，为科学实验研究、临床治疗和骨组织工程快速扩增干细胞提供了可行的方法和依据。

附图说明

图1为本发明一实施方式的实验探究步骤流程图。由图可见，首先制备了具有不同浓度si、sr以及si-sr组合的浸提液培养基，通过培养hbmsc筛选出了促进其快速扩增的最佳si-sr组合浓度，并进一步探究了此浓度对干细胞干性的影响；

图2为含不同浓度单一si培养基对人骨髓间充质干细胞增殖的影响。由图可见，单一si在稀释至1/16-1/64之间，对照表1，单一si浓度在1.259-5.18ppm能够明显促进hbmsc增殖，并且单一si在2.59ppm处具有极明显的促进增殖效果；

图3为si浓度为2.59ppm，添加不同浓度sr后si-sr组合以及对应相同浓度单一sr对人骨髓间充质干细胞增殖的影响。由图可见，单一sr浓度在0.32-40.39ppm均对hbmsc增殖有促进作用，si(2.59pm)与sr组合后，si(2.59ppm)-sr(2.52-40.39ppm)能够更明显的促进细胞增殖，其中si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)促进效果最显著。同时单一si(2.59ppm)促进细胞增殖率为11.10％，单一sr(20.20ppm)促进细胞增殖率为16.89％，两者叠加起来仍小于实际si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)组合促进细胞增殖率47.48％，说明si-sr组合对于促进hbmsc增殖存在协同效应；

图4为单一si(2.59ppm)、单一sr(20.20ppm)和si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)组合在促进干细胞增殖过程中对干细胞干性的影响。如图可见，单一si(2.59ppm)和单一sr(20.20ppm)在维持干细胞干性方面均有作用，但是si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)组合具有极其明显的效果，对于四个干性相关基因，单一si(2.59ppm)相比对照组提高干性率与单一sr(20.20ppm)提高干性率两者叠加起来仍明显小于实际si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)组合相比对照组提高干性率，说明si-sr组合对于维持hbmsc干性存在协同效应。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明一实施方式提供一种能够体外高效扩增人骨髓间充质干细胞并保持其干性的培养基。该培养基含有si离子和sr离子中的至少一种。该培养基中，si离子的存在形式可为sio4^4-。sr离子的存在形式可为sr²⁺。

一个示例中，所述培养基含有单一si离子，其中si离子的浓度可为1～10ppm，优选为1.259～5.18ppm，更优选为1.5～5ppm，进一步优选为2.59ppm。

另一示例中，所述培养基含有单一sr离子，其中sr离子的浓度可为2～50ppm，优选为2.52～40.39ppm，更优选为10.5～40ppm，进一步优选为20.20ppm。

又一示例中，所述培养基同时含有si离子和sr离子，其中si离子的浓度可为1～10ppm，优选为1.259～5.18ppm，更优选为1.5～5ppm，进一步优选为2.59ppm，sr离子的浓度可为2～50ppm，优选为2.52～40.39ppm，更优选为10.5～40ppm，进一步优选为20.20ppm。培养基中同时含有si离子和sr离子时，si离子和sr离子对促进hbmsc增殖及保持其干性存在协同效应，即、其促进效果大于单一si离子和单一sr离子的叠加。si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)在此浓度能明显促进干细胞增殖，并在促进干细胞快速扩增过程中协同保持干细胞干性。在所述培养基中，如果si离子和/或sr离子的浓度过大，则会有一定细胞毒性；如果si离子和/或sr离子的浓度过小，则难以起到高效扩增人骨髓间充质干细胞并保持其干性的作用。

所述培养基的基础组分(除上述si离子和/或sr离子以外的组分)可为本领域公知的hbmsc培养基，例如hbmsc专用完全培养基。所述hbmsc专用完全培养基可购自商用，例如购自赛业生物科技有限公司，型号为huxma-03011-440。

所述培养基可以是含有单一si、sr或si-sr组合的离子浸提液。一个实施方式中，以hbmsc专用完全培养基为提取溶剂，制备上述离子浸提液。制备含有单一si的离子浸提液时，可以对casio3粉体进行浸提，由于浸提过程中发生矿化导致浸提原液中ca离子浓度很低，而hbmsc专用完全培养基中ca离子浓度较高，浸提原液经过hbmsc专用完全培养基稀释后ca离子浓度均与hbmsc专用完全培养基中ca浓度一致，因此即可忽略ca离子的影响。casio3可由ca(no3)2·4h2o(例如购自国药)和nasio3·9h2o(例如购自国药)经过沉淀法制备，经800℃～1500℃煅烧。所得的casio3的纯度为99％以上。casio3陶瓷可以是1μm-10mm的颗粒或陶瓷块体，粒径优选为30μm-150μm，此粒径范围内的casio3陶瓷易获得，浸提较方便且浸提原液离子浓度适中便于后期原液稀释。制备含有单一sr的离子浸提液时，可以对sro粉体(例如购自阿拉丁)进行浸提。sro粉体的纯度优选为99.7％以上，粒径优选为30μm-150μm，此粒径范围内的sro粉体易获得，浸提较方便且浸提原液离子浓度适中便于后期原液稀释。制备含有si-sr组合的离子浸提液时，可以对srsio3粉体进行浸提，也可以将上述casio3浸提液、sro浸提液、srsio3浸提液中的任意两种以上混合。srsio3可由sr(no3)2(例如购自国药)和nasio3·9h2o(例如购自国药)经过沉淀法制备，经800℃～1500℃煅烧。所得的srsio3陶瓷的纯度为99％以上。srsio3陶瓷可以是1μm-10mm的颗粒或陶瓷块体，粒径优选为30μm-150μm，此粒径范围内的srsio3陶瓷易获得，浸提较方便且浸提原液离子浓度适中便于后期原液稀释。得到的浸提原液还可以通过hbmsc专用完全培养基进行稀释以得到所需浓度。

一个示例中，含不同浓度单一si、sr和si-sr组合离子浸提液的制备方法为：按照iso10993-5标准制备粉体浸提液，所用培养基为hbmsc专用培养基，纯casio3粉体用于制备含si浸提液，纯sro粉体用于制备含sr浸提液，纯srsio3粉体用于制备含si-sr浸提液，最后将浸提原液通过hbmsc专用完全培养基梯度配比稀释。

在不影响本发明的目的的情况下，所述培养基中还可以含有其它组分。

以下，说明获得si、sr离子的最优作用浓度的步骤以及si、sr离子的浓度对干细胞干性的影响。

在此，通过含si、sr离子浸提液培养细胞的方法，探究了si-sr离子组合促进骨髓间充质干细胞增殖的最优浓度组合，并发现si-sr离子组合在此浓度下不仅能促进干细胞快速扩增，还能保持干细胞的干性。该体外扩增干细胞方法简单易行、低成本、可规模化获得大量具有良好干性的骨髓间充质干细胞。

一个实施方式中，如图1所示，获得si、sr离子的最优作用浓度的步骤以及si、sr离子的浓度对干细胞干性的影响包括以下步骤：(1)含不同浓度单一si、sr和si-sr组合离子浸提液的制备；(2)将步骤(1)中获得的含单一si、sr和si-sr组合的离子浸提液hbmsc专用完全培养基培养hbmsc，并将hbmsc专用完全培养基作为空白对照组，采用cck8法检测细胞增殖性能，筛选促进人骨髓间充质干细胞增殖的最优si-sr组合浓度；(3)将步骤(2)中获得的促进人骨髓间充质干细胞增殖的最优si-sr组合浓度及其对应的相同浓度的单一si、sr离子浸提液hbmsc专用完全培养基培养人骨髓间充质干细胞，并将hbmsc专用完全培养基作为空白对照组，采用sybrgreen荧光实时定量pcr来检测干细胞干性相关因子mrna的表达。

(1)、不同浓度si、sr和si-sr组合的浸提液的制备：

通过casio3、sro和srsio3粉体制备含单一si、单一sr和si-sr组合浸提液，以粉体和hbmsc专用培养基质量体积比为200mgml^-1添加，密封至于37℃恒温摇床中浸提24h。然后将浸提原液通过专用完全培养基梯度配比稀释，获得具有不同浓度si、sr和si-sr组合的浸提液，并通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得离子浓度。

(2)、促进人骨髓间充质干细胞增殖的最优si-sr组合浓度的筛选：

a)将步骤(1)中获得的含不同si、sr和si-sr组合的hbmsc完全培养基培养人骨髓间充质干细胞，并将hbmsc专用完全培养基作为空白对照组。其中，用于培养人骨髓间充质干细胞增殖的培养液中单一si浓度范围为0.162～41.44ppm，单一sr浓度范围为0.32～40.39ppm，si-sr组合浓度范围为si(2.59ppm)-sr(0.32～40.39ppm)。

b)以800个细胞/孔的密度将hbmsc接种到96孔细胞培养板中，每个浓度设置6个平行孔实验，细胞贴壁24h后，将培养基换成100μl/孔的不同浓度的离子浸提液完全培养基继续培养，并隔天换液，到达预设的时间1、3和7天后，采用cck8法检测细胞增殖性能。

c)首先筛选出单一si促进人骨髓间充质干细胞增殖的最优作用浓度，在此基础上添加不同浓度的sr离子，进一步筛选促进人骨髓间充质干细胞增殖的最优si-sr组合浓度。筛选出的促进人骨髓间充质干细胞增殖的最优si-sr组合，si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)在此浓度能明显促进干细胞增殖。

(3)、最优si-sr组合浓度对干细胞干性的影响：

a)将步骤(2)中得到的促进人骨髓间充质干细胞增殖的最优si-sr组合浓度及其对应的相同浓度的单一si、sr离子hbmsc专用完全培养基培养人骨髓间充质干细胞，并将hbmsc专用完全培养基作为空白对照组。

b)以2.0*10^5个细胞/孔的密度将第四代hbmsc接种到6孔细胞培养板中，待12h细胞贴壁后，培养基换成2ml/孔含有最优si-sr组合浓度及其对应相同浓度的单一si、sr离子的培养基和空白对照组培养基，48h后当细胞达到80％-90％的汇合度，收集部分细胞并以1:2比例传代。

c)按照以上方法一直传代到第八代，分别收集第4代、第6代和第8代细胞。

d)采用sybrgreen荧光实时定量pcr来检测干细胞干性相关因子的表达。所述的促进人骨髓间充质干细胞增殖最优si-sr组合，si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)在此浓度能在促进干细胞快速扩增过程中协同保持干细胞干性。

本发明利用hbmsc完全培养基与si、sr离子组合复配，找到了细胞生长的极佳环境，最终实现了快速扩增骨髓间充质干细胞并保证其干性的目的。经过反复实验验证，培养效果极佳。具体而言，制备具有不同si，sr浓度的浸提液，在不同si，sr以及si-sr组合浓度下培养hbmsc，检测细胞增殖以及干性指标。实验表明，si，sr对促进干细胞增殖存在协同效应，si-sr组合在适宜浓度能明显促进干细胞增殖，并保持干细胞干性。

本发明的有益效果：

(1)制备工艺简单易行；(2)成本低廉且便于推广；(3)更高的体外扩增速率；(4)解决了体外培养骨髓间充质干细胞易失去多向分化潜能的问题。

综上所述，应用本发明方法能够在体外短期内获得大量保持良好干性的骨髓间充质干细胞，可以用于科学研究、临床治疗和组织工程等。

下面通过介绍本发明的实施例，以进一步阐明本发明实质性特点和显著的进步。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

以下实施例中，casio3以分析纯ca(no3)2·4h2o(购自国药)和na2sio3·9h2o(购自国药)为原料，采用化学沉淀法制备casio3粉体。首先将na2sio3·9h2o，ca(no3)2·4h2o分别溶于去离子水中，配制成浓度均为0.5mol·l^-1的水溶液，再将ca(no3)2溶液缓慢滴入强烈搅拌的na2sio3溶液中，直到滴加完毕。继续搅拌24小时，将反应所得沉淀过滤，用去离子水及无水乙醇各洗涤3次后置于60℃恒温干燥箱内干燥48小时。最后将所得的前驱体粉体在900℃煅烧2小时，再经过研磨过200目筛，得到纯度大于99％，粒径小于70μm的casio3粉体。srsio3以分析纯sr(no3)2(购自国药)和na2sio3·9h2o(购自国药)为原料，采用化学沉淀法制备srsio3粉体。首先将na2sio3·9h2o，sr(no3)2分别溶于去离子水中，配制成浓度均为0.5mol·l^-1的水溶液，再将sr(no3)2溶液缓慢滴入强烈搅拌的na2sio3溶液中，直到滴加完毕。继续搅拌24小时，将反应所得沉淀过滤，用去离子水及无水乙醇各洗涤3次后置于60℃恒温干燥箱内干燥48小时。最后将所得的前驱体粉体在900℃煅烧2小时，再经过研磨过200目筛，得到纯度大于99％，粒径小于70μm的srsio3粉体。sro购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，型号为1314-11-10，hbmsc专用培养基购自赛业生物科技有限公司，型号为huxma-03011-440。

实施例1：

单一si对人骨髓间充质干细胞增殖的影响：

(1)按照iso10993-5标准制备casio3浸提液。以粉体和hbmsc专用培养基质量体积比200mgml^-1将粉体添加到培养基中，密封置于37℃恒温摇床中浸提24h，4000rpm离心10min，取上清液并经过0.22μm滤菌膜过滤后得到200mgml^-1casio3浸提原液。将200mgml^-1的casio3浸提原液用hbmsc专用完全培养基稀释至1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128以及1/256，置于4℃冰箱待用，并通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得离子浓度(见表1)；

(2)以800个细胞/孔的密度将hbmsc接种到96孔细胞培养板中，每个浓度设置6个平行孔实验，使用hbmsc完全培养基培养的对照组作为空白对照(cont)，casio3浸提液作为实验组。细胞贴壁24h后，将培养基换成100μl/孔的梯度稀释的casio3浸提液完全培养基和空白对照组培养基继续培养，并隔天换液；

(3)到达预设时间的1、3和7天后，采用cck8法检测细胞增殖活性。

表1梯度稀释单一si浸提液培养基中的si浓度(μgml^-1)

图2显示，与空白对照组相比，casio3浸提液完全培养基在适宜si浓度范围内能够明显促进hbmsc增殖。稀释casio3浸提原液至1/16-1/64，对应si浓度为5.18-1.295ppm能促进hbmsc增殖，其中稀释至1/32，对应si浓度为2.59ppm具有更明显的促进增殖效果。

实施例2：

si-sr组合以及对应相同浓度单一sr对人骨髓间充质干细胞增殖的影响：

(1)按照iso10993-5标准制备casio3、srsio3和sro浸提液。以粉体和hbmsc专用培养基质量体积比200mgml^-1将粉体添加到培养基中，密封置于37℃恒温摇床中浸提24h，4000rpm离心10min，取上清液并经过0.22μm滤菌膜过滤后得到200mgml^-1casio3、srsio3和sro浸提原液。通过电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测得原液离子浓度；

(2)将casio3浸提原液用hbmsc专用完全培养基稀释至si浓度为2.59ppm。通过casio3浸提原液和srsio3浸提原液混合，用hbmsc专用完全培养基稀释si浓度为2.59ppm，同时sr浓度分别为40.39ppm、20.20ppm、10.10ppm并依次减半，直至sr浓度为0.32ppm(见表2)。将sro浸提原液用hbmsc专用完全培养基稀释至sr浓度与si-sr组合中sr浓度分别相同(见表3)，置于4℃冰箱待用；

(3)以800个细胞/孔的密度将hbmsc接种到96孔细胞培养板中，每个浓度设置6个平行孔实验，使用hbmsc完全培养基培养的对照组作为空白对照(cont)，单一sr浸提液作为实验组对照，si-sr组合浸提液作为实验组，待细胞贴壁24h后，将培养基换成100μl/孔的si-sr组合浸提液、单一sr浸提液完全培养基和空白对照组培养基继续培养，并隔天换液；

(4)到达预设时间的1、3和7天后，采用cck8法检测细胞增殖活性。

表2梯度稀释单一sr浸提液培养基中的sr浓度(μgml^-1)

表3不同浓度si-sr组合浸提液培养基中的si、sr浓度(μgml^-1)

图3显示，与空白对照组相比，单一sr浸提液完全培养基在sr浓度为0.32-40.39ppm能够促进hbmsc增殖，si-sr组合固定si浓度为2.59ppm，梯度加不同浓度sr后发现，si(2.59ppm)-sr(2.52-40.39ppm)均能促进细胞增殖，其促进效果要高于对应单一si和单一sr。其中si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)组合能够更加明显的促进hbmsc增殖。同时在此浓度单一si促进增殖百分比(11.10％)与单一sr促进增殖百分比(16.89％)叠加后仍小于si-sr组合促进增殖百分比(47.48％)，说明si-sr组合在促进增殖中具有协同效应。

实施例3：

(1)选取最优si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)组合浸提液完全培养基为实验组，单一si(2.59ppm)和单一sr(20.20ppm)浸提液完全培养基为实验对照组，hbmsc完全培养基为空白对照组；

(2)以2.0*10^5个细胞/孔的密度将第四代hbmsc接种到6孔细胞培养板中，待12h细胞贴壁后，培养基换成2ml/孔含有最优si-sr组合浓度及其对应相同浓度的单一si、sr离子的浸提液完全培养基和空白对照组培养基，48h后当细胞达到80％-90％的汇合度，收集部分细胞并以1:2比例传代；

(3)按照以上方法一直传代到第八代，分别收集第4代、第6代和第8代细胞；

(4)采用sybrgreen荧光实时定量pcr来检测干细胞干性相关因子(nanog、oct4、sox2、tert)的表达。

图4显示，与空白对照组相比，单一si(2.59ppm)和单一sr(20.20ppm)浸提液完全培养基能够刺激hbmsc在增殖过程中维持部分干性，但是si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)组合在维持干细胞干性中起到了更加明显的作用，其维持干性效果要高于对应单一si和单一sr的叠加效果，说明si(2.59ppm)-sr(20.20ppm)组合能够在协同刺激干细胞快速扩增过程中，进一步协同维持干细胞干性。