与甘蓝叶片表皮毛有无紧密相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及与甘蓝叶片表皮毛有无紧密相关的分子标记及其应用。

背景技术：

植物表皮毛是从其各个器官表皮延伸出来的毛状结构，它们行使着多种功能，包括保护植物免受病原体、食草动物、紫外线辐射、以及干旱和冰冻的侵害。表皮毛广泛存在于芸薹属物种，如白菜、甘蓝型油菜和芥菜中一些类型和品种。甘蓝的某些野生类型(比如brassicaincana和b.villosa)长期生在在严苛的自然环境中，也保留了植株表皮毛的特征，表明表皮毛对于其生存能力的积极作用。然而目前的所有栽培甘蓝类型均表现为无表皮毛，比如结球甘蓝、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、芥蓝、抱子甘蓝等。利用野生甘蓝资源培育具有表皮毛的栽培甘蓝，对提高栽培甘蓝的抗虫、抗病、耐干旱及冻害能力，减少农药施用量与成本投入都有积极意义。

在模式之物拟南芥中，表皮毛的形成主要受到ttg1-gl1-gl3三聚体复合激活因子激活，但同时受到一些反向调节因子的调节，如try和cpc等。上述激活因子与反向调控因子共同作用并形成了一个反馈调节循环机制，在这个循环中，激活子相关基因的表达可激活抑制因子的表达，但激活子的表达同时又受到抑制因子的调控。此外，在蛋白水平，try或者cpc还可取代gl1蛋白与gl3结合，从而使这个复合三聚物失活。

目前通过图位克隆技术已经确认白菜的ttg1是白菜表皮毛形成的调节因子(zhangetal.,2009)，同时也发现gl1基因与白菜和油菜叶片的表皮毛有关(lietal.,2011；gruberetal.,2006)，但还没有鉴定控制野生甘蓝b.incana表皮毛的基因。

技术实现要素：

本发明的目的是为甘蓝品种选育提供一种新选择。

本发明的技术方案是甘蓝叶片表皮毛有无紧密相关的分子标记boltrichome-caps01，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

该分子标记总长659bp，snp出现在378bp，下划线所示为snp，无毛甘蓝为a，有毛甘蓝为g。酶切位点在373-374bp之间。该分子标记的扩增产物在酶切时所使用的限制性内切酶为xagi(又叫econi)。

ttaaaatttggaagatggaggcaagaaatgtgtgttgtttctcatgatccaatatctctctatctccacagcttttcttcccggtactcttcctgctattatttcccacctggtattttgcaagaaaacatttttctctctaagaatggaaatacataagtaaataataaaatgtttgatacaagtgattagcttggatcccattctgcttattaagctaagaagtccctaagcgtagcaaaaagttaaaaaaaaaaacacctagacactaaaacttaggtctagtagttcctaattaatgaaactacgtacaaactataactaattagaacaagaacatgaagcagcaattgaaagatcaagtaggcctaagagagagcaaggacacttagaccagaaggcgatggtgattcaaaaggtcactctgaaacgacaagaacgattttcttcatcatcaggagatggttattttttttttttgtttgttcaacagatcatcaggcgatggtaagcgtaagaatataagtacattcctatgtcatatgttttgtggtaaagtcgttacatctaattttgggagagaaagaaattaaaagaagatacgtacctatcgcctacgagtctgtacattcttaagatgagatcttcctcctgttggc

本发明还提供了甘蓝叶片表皮毛有无紧密相关的分子标记boltrichome-caps01的正向引物，其正向引物序列具有如seqidno.2所示的核苷酸序列(5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’)，反向引物序列具有如seqidno.3所示的核苷酸序列(5’-gccaacaggaggaagatctca-3’)。

本发明还提供了甘蓝品种的鉴定方法，包括如下步骤：以待鉴定品种的基因组dna为模板，扩增分子标记boltrichome-caps01，采用限制性内切酶xagi酶切扩增产物，酶切结果进行电泳，电泳后出现659-bp的单一条带的为无表皮毛的纯合品种，出现276-bp和373-bp两条带为有表皮毛的纯合品种，同时出现659-bp、276-bp和373-bp三种条带的为无表皮毛的杂合品种；所述的扩增分子标记的引物对具有如seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了所述的分子标记在甘蓝育种中的用途。

本发明还提供了所述的分子标记在选育不同表皮毛性状的甘蓝品种中的用途。

本发明还提供了所述的分子标记引物在甘蓝育种中的用途。

本发明还提供了所述的分子标记引物在选育不同表皮毛性状的甘蓝品种中的用途。

本发明还提供了所述甘蓝品种的鉴定方法在甘蓝育种中的用途。

本发明还提供了所述甘蓝品种的鉴定方法在选育不同表皮毛性状的甘蓝品种中的用途。

本发明的有益效果：

该分子标记可直接在甘蓝表皮毛育种中应用。通过表皮毛相关分子标记的早期鉴定和辅助选择，可尽早确认纯合的有毛个体，并选择出杂合个体进入下一轮选择，减轻田间材料的种植规模和后期鉴定工作，有效提高选择的效率和准确性。

附图说明

图1为甘蓝表皮毛性状snp芯片分析结果及候选基因位置

上图表示c01染色体的δ(snp-index)分布情况，红色虚线表示p＝0.001显著水平时的阈值；下图展示表皮毛候选区间(灰色)及候选基因botry在c01染色体上的位置。

图2为功能标记所使用限制性内切酶xagi的酶切位点示意图；图中序列是基因botry中含snp的那部分序列，这个snp的存在恰好使有毛的这段序列可以被酶切开，而无毛的不能被切开。

c01(有毛)aaagatcaagtaggcctaagagagggcaaggacacttagaccagaaggcgc41(无毛)aaagatcaagtaggcctaagagagagcaaggacacttagaccagaaggcg

c01为有毛甘蓝亲本，c41为无毛甘蓝亲本，序列中白色背景表示双亲snp位点，线条指示序列为xagi可识别的碱基序列，黑色倒三角代表酶切位点。

图3为功能标记在有毛和无毛甘蓝中的检测情况示意图

m代表marker，c01代表有毛甘蓝亲本，c41代表无毛甘蓝亲本，f1代表杂种f1，undigested表示没有被酶切。

具体实施方式

以下为本发明方法的一种具体实施方式，但并不是对本发明方法的限定，任何不超离本发明实质内容的变换，仍应属于本发明的保护范围。

实施例1分子标记的获得

一份无毛甘蓝c41(b.oleraceavar.alboglabra，从荷兰种质资源库征集，征集编号cgn17275)与一份有毛野生甘蓝b.incana(从德国植物遗传与作物研究所征集，征集编号bra1166)发展的f2分离群体为例，详细说明获得与表皮毛有无精密相关分子标记的方法，具体如下：

(一)群体构建及表型鉴定：

以一份无毛甘蓝与一份有毛野生甘蓝b.incana杂交产生f1代，f1代再自交，种植于大田，获得f2代植株。植株的10叶期通过肉眼观察第一叶上表皮毛的有无。

(二)snp芯片分析

随机选择94份f2植株，于苗期采集幼嫩叶片，采用ctab法提取dna(doyle,1991)，纯化后进行油菜60ksnp芯片分析(illuminainc.,ca,usa)，将获得的snp对应到甘蓝参考基因组(http://brassicadb.org/brad/index.php)，并依照takagi方法进行的(takagietal.，2013)将snp结果与表皮毛表型进行关联分析，从c01号染色体上检测到一个显著的关联区间，该区间跨度1.04mb(如图1)。

(三)候选基因分析：

从公共数据库(http://brassicadb.org/brad/index.php)查询上述1.04-mb区间内的所有甘蓝基因，根据对应功能注释和与植物表皮毛有关的现有文献，筛选到一个与表皮毛发育有关的基因botry(如图1)。

(四)功能标记转化与检测：

对无毛甘蓝亲本和有毛甘蓝亲本提取dna，利用illuminahiseq2500测序平台进行重测序分析，发现两者的botry基因在编码区存在snp。根据甘蓝botry基因序列，设计可扩增出上述snp位点的引物，其正向引物序列为5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’，反向引物序列为5’-gccaacaggaggaagatctca-3’。根据上述snp类型及附近序列，确定能辨别其碱基类型的限制性内切酶为xagi(如图2)。

在无毛和有毛亲本、f1植株以及19个f2材料中进行pcr扩增和xagi酶切，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，发现无毛亲本及7份无毛f2仅出现659-bp的单一条带(不可酶切型)；有毛亲本及7份有毛f2植株出现276-bp和373-bp两种特异条带(可酶切型)；f1及5份无毛f2植株同时出现659-bp、276-bp和373-bp三种条带(杂合型)，确定其为杂合基因型植株(如图3)。

实施例2所述分子标记的应用

一种与甘蓝叶片表皮毛有无紧密相关的分子标记在甘蓝育种中的应用，其步骤是：

以无毛甘蓝c41和有毛甘蓝c01(材料来源同实施例1)杂交发展的50份f2植株(非实施例1中用于snp芯片分析的材料)为研究材料，该部分植株中有17份表现有毛，33份表现无毛。利用实施例1中所发展的标记进行鉴定，步骤如下：

1)以甘蓝单株dna为模板；

2)利用下述引物进行pcr过程：

引物的正向序列为：5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’

引物反向序列为：5’-gccaacaggaggaagatctca-3’；

3)pcr反应体系：总体积为10μl，具体成分如下表：

表1扩增体系

4)pcr扩增程序：94℃5min，[94℃45s，55℃45s，72℃1min]×35循环，72℃10min。运行完毕后4℃条件下保存。

5)pcr扩增产物的酶切：每10μl用2.5u的限制性酶xagi在37℃条件下处理1h；

4)酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离后，仅出现659-bp单一条带(不可酶切型)的有14份材料，其表现均为无毛；仅出现276-bp和373-bp两种特异条带(可酶切型)的有17个，均为有毛个体；同时出现659-bp、276-bp和373-bp三种条带(杂合型)的有19份材料，均表现为无毛，推测其为杂合基因型植株。

5)选择上述“4)”中出现659-bp单一条带的材料3份(无毛)，仅出现276-bp和373-bp两种特异条带的材料3份(有毛)，同时出现659-bp、276-bp和373-bp三种条带的杂合材料3份(无毛)，分别自交产生f2：3家系，种植于大田后调查苗期表皮毛表型。发现前2类材料的表型不发生分离，且均与上代表型一致；上代表现为三种条带的3份无毛材料，其f2:3家系均出现表皮毛性状的分离现象。该具体结果见附表1。

表1酶切结果

6)对表1中的258份f2:3植株进行分子标记鉴定，上一世代为可酶切型和不可酶切型的植株，其f2:3植株的酶切结果与上一世代完全相同；上一世代为杂合型的植株，其产生的97份f2:3植株的酶切结果出现分离，其中19份有毛个体均被酶切(即为可酶切型)，其余78份无毛个体中，有23份不能被酶切(即为不可酶切型)，55份表现为杂合型。

上述鉴定结果表明，在育种中通过功能分子标记鉴定与筛选，保留仅出现276-bp和373-bp两种特异条带的材料即为纯合有毛材料；保留同时出现659-bp、276-bp和373-bp三种条带的材料，可提高下一轮选择的效率和准确性，减轻后期筛选鉴定的工作量(理论上可减少33％)，加速育种进程。

sequencelisting

<110>西南大学

<120>与甘蓝叶片表皮毛有无紧密相关的分子标记及其应用

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>659

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>分子标记boltrichome-caps01

<220>

<221>snp位点

<222>(378)..(378)

<223>n为a或g

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ttaaaatttggaagatggaggcaagaaatgtgtgttgtttctcatgatccaatatctctc60

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caagaaaacatttttctctctaagaatggaaatacataagtaaataataaaatgtttgat180

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cactctgaaacgacaagaacgattttcttcatcatcaggagatggttatttttttttttt480

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