一种制备褐藻寡糖的方法与流程

本发明属于功能性小分子制备技术领域，具体涉及一种制备褐藻寡糖的方法。

背景技术：

褐藻胶是源自于褐藻植物的细胞壁的水溶性酸性多糖，其主要由α-l-古罗糖醛酸和β-d-甘露糖醛酸组成。在目前的研究中，褐藻胶主要用来降解制备褐藻寡糖。

海藻寡糖分子量低，水溶性强，稳定性高，实验和临床已经发现海藻寡糖具有免疫调节、降血压、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗凝血及抗病毒等多种生理活性，还可以作为糖尿病、肥胖症、直肠结肠癌、习惯性便秘患者的疗效食品。在药物研制、功能食品开发、绿色农业等领域具有广阔的开发应用前景。并且，褐藻寡糖具有抗氧化、免疫调节等多种不同的生物学活性，且寡糖存在分子量小，容易被吸收利用的优势，因此在药物制剂、功能食品、化工等多个领域具有广阔的应用前景，是一种最新一代的功能性低聚糖。

目前通过褐藻胶来制备褐藻寡糖有多种方法，例如酸法降解、超声降解、氧化降解、酶降解法等。其中酶法降解相较于化学法制备反应温和、易于控制，耗能低，产物回收率较高以及不会产生严重的污染等优点。但是，现在使用褐藻胶酶降解褐藻胶制备的寡糖为二糖至五糖的混合物(p2-p5)，还需要通过凝胶柱层析分离才能获得单一的寡糖组分(欧昌荣等，微生物发酵-膜分离法制备褐藻胶寡糖及其产物分析，微生物学报，45卷第2期，2005年4月)。但上述的分离方法避免不了会增加成本。因此，如何在酶解过程中控制酶解产物的均一性一直是褐藻胶寡糖制备领域的研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种制备褐藻寡糖的方法，制备的褐藻寡糖主要为褐藻寡糖二糖和三糖，从而弥补现有技术的不足。

本发明的方法，是使用具有褐藻胶降解活性的酶来降解褐藻胶，从而制备褐藻寡糖；其中使用的酶包含有：

1)氨基酸序列为seqidno:1的酶；

2)将seqidno:1所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有1)的酶活性的，由1)衍生的酶；

编码上述酶的基因，其一种编码核苷酸序列为seqidno:2；

本发明的方法，其一种具体的操作如下：将褐藻胶配成重量百分比浓度为1-2％的水溶液，将酶加入到褐藻胶水溶液中，在35-37℃下进行培育反应；反应结束后进行离心获得上清液；将上清液进行冷冻干燥后的褐藻寡糖。

上述的方法中，所述的离心条件是在4℃，12000rpm离心30min。

上述方法制备的褐藻寡糖通过凝胶柱层析分离获得单一的组分。

本发明方法使用筛选获得的蛋白酶来酶解褐藻胶，从而使反应的副产物更少，有利于后续更方便的通过胶柱层析来分离单一寡糖，从而有效的提高了制备褐藻寡糖的效率，节省了成本。

附图说明

图1：本发明酶与ncbi编号为wp_017069952.1的海藻酸裂解酶的blstp结果图；其中query为本发明的酶，subject为wp_017069952.1的海藻酸裂解酶；

图2：本发明酶的基因扩增图；

图3：本发明筛选的酶对褐藻胶的降解产物的层析电泳图，其中1为ncbi编号为wp_017069952.1的酶的产物；2为本发明筛选酶的降解产物。

具体实施方式

目前褐藻胶寡糖的制备包括化学方法和酶解方法，其中一种操作方法是通过筛选能产生褐藻胶酶的微生物，然后以褐藻胶为唯一碳源诱导产生具有褐藻胶裂解活性的酶，从而降解褐藻胶来制备寡糖。申请人的单位一直从事制备医药领域使用的褐藻胶寡糖。通过从海带中筛选具有褐藻胶降解活性的菌；再以海藻酸钠为唯一碳源，通过驯化培养、初筛、复筛获得了一株能特异性的降解褐藻胶制备寡糖的菌(实验室命名为pxy-1)。对产物进行薄层层析后发现相比于已有的能够产生褐藻胶酶的菌株，该筛选菌株中二糖和三糖的产量有显著的增加。在对该菌进行了全基因组测序后，对序列进行了生物信息学分析，获得了一种酶蛋白，对该酶蛋白进行重组表达，降解褐藻胶后，确定其为能特异性的降解褐藻胶，产物主要为褐藻胶二糖和三糖的酶。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：蛋白酶的筛选及酶学性质分析

一、通过商业测序基因公司对pxy-1菌株的通过鸟枪法进行全基因测序，测序进行拼接后获得了全基因组序列。再对全基因组进行注释后，将序列与已公布的褐藻胶酶进行比较，发现了疑似具有褐藻胶降解功能的序列，其核苷酸序列如下(序列表中编号为seqidn0：2)：

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其翻译过的氨基酸序列如下(序列表中编号为seqidn0：1)：

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将上述的序列与ncbi中进行blastp比对，结果发现与ncbi编号为wp_017069952.1的海藻酸裂解酶序列上最接近。但是，通过alignment比较发现，本发明所筛选的酶与ncbi编号为wp_017069952.1的海藻酸裂解酶相比，很多位点上存在氨基酸的差异。更重要的是，本发明的酶与海藻酸裂解酶存在大段的氨基酸序列的插入缺失差异(图1)。

为了验证本发明筛选的氨基酸序列为seqidno:1的酶的功能，对该酶进行了重组表达，并验证了酶学性质及降解褐藻胶的能力。

实施例2、酶的重组表达

1)根据酶基因的序列设计上游引物和下游引物，用pcr扩增得到基因全序列。pcr条件为：94℃预变性3min，随后以94℃30s、55℃30s、72℃2min进行30个循环，最后在72℃延伸5min。以上游引物和下游引物扩增酶编码基因的全序列(图1)，用t4连接酶连接扩增的片段和表达载体pproexhta用ecorⅰ和hindⅲ酶切，用t4连接酶连接表达质粒pgex6p-1，热激转入大肠杆菌bl21中。

随机挑取单克隆菌落，测序分析获得阳性克隆重组菌株。

2)重组酶的制备

将筛选后的的阳性重组菌株单克隆接种在含有氨苄青霉素的lb液体培养基中进行扩大培养，在37℃摇床培养12h后制成种子液。再取种子液接入含有氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃摇床培养至od600值为0.5-0.6时，加入iptg进行诱导表达。继续培养后，4℃6000rpm离心10分钟得到发酵粗酶液。

粗酶液硫酸铵沉淀

离心得到的发酵粗酶液进行70％硫酸铵沉淀。冰水浴保温，磁力搅拌的条件下均匀缓慢地向发酵粗酶液加入粉碎并干燥的硫酸铵。4℃静置过夜后离心收集沉淀，用20mmph8.0tris-hcl缓冲液复溶沉淀，并在此缓冲液中透析。用ph8.0的20mmtris-hcl缓冲液充分平衡deaesepharoseff离子交换柱(10cmx1.2cm)，上样吸附。然后用ph8.0的20mmtris-hcl含有nacl(0.1-0.6mofnacl)进行梯度洗脱,收集od280出峰的平衡液及洗脱液。对收集管中的溶液进行冷冻干燥后获得重组酶。

实施例3、酶学性质分析

1、酶活测定

采用紫外吸收法测定本发明筛选的酶的比活力，测定本发明的酶对褐藻酸钠(检测的时候用于替代褐藻胶)降解的比活力值为20-22unit/ml，能满足生产的需要。

2、ph对酶活的影响

每一试管中加入3ml粗酶液和15ml浓度分别为1.5％的褐藻胶水溶液，置放于不同的ph条件下，反应30分钟后，加热使酶失活，测定235nm处吸光度。结果表明酶的最适反应ph为7.5。ph过高或过低都会对酶活性产生影响,使酶活降低。

3、温度对酶活的影响

每一个试管中加入3ml粗酶液和15ml浓度分别为1.5％的褐藻胶水溶液，调节ph为7.5，置于不同温度条件下，反应30分钟后，加热使酶失活，测定235nm处吸光度。结果酶的最适应温度为34-37℃。初始阶段着温度的升高酶活性逐渐增高，至37℃时随着温度的升高酶活性开始降低。

实施例4：用重组表达的酶降解褐藻胶制备褐藻寡糖

将本发明重组表达的氨基酸序列为seqidno:1的酶来降解褐藻胶来制备褐藻寡糖，将褐藻胶(平均分子量20000)配成重量百分比浓度为1％的水溶液，按照重量比1:80的比例将酶加入到褐藻胶水溶液中作为实验组。同时，将编号为wp_017069952.1的酶(氨基酸序列为seqidno:3)按照实施例1中的步骤进行重组表达，作为实验组；对照组和实验组各做三个平行试验。

将对照组和实验组在35℃下进行培育，培育时间为12h。反应结束后12000rpm离心5min，取上清通过薄层层析方法(tlc法)对上清液中的降解产物进行分析。具体就是分别取实验组和对照组的上清液3μl，点样于硅胶板上(silicagel60f254，merck)。吹干后将硅胶板置于展开剂中开始层析，展开剂按以下比例配置：正丁醇/甲酸/水(v/v)＝4:6:1。层析结束后，取出硅胶板并吹干，在硅胶板上喷洒显色剂(苯胺-二苯胺显色剂)，吹干，再将硅胶板置于高温条件下显色，直至出现明显的斑点。检测结果如图3所示，结果表明，相比于编号为wp_017069952.1的酶，本发明筛选的酶对褐藻胶的降解产物主要是褐藻胶寡糖的二糖和三糖；经过质谱鉴定，降解产物为dp1和dp2(褐藻寡糖的二到五寡糖的分子量分别为175da、351da、527da、703da)；而wp_017069952.1酶降解的产物从褐藻寡糖二糖到五糖都有相应的产物。

上述结果表明本发明筛选的酶能特异性的降解褐藻胶为二糖和三糖，有利于后续更方便的通过胶柱层析来分离单一寡糖。

实施例5：制备褐藻寡糖

将褐藻胶配成重量百分比浓度为1-2％的水溶液，将实施例2制备的重组酶加入到褐藻胶水溶液中，在35-37℃下进行培育反应；采用dns法测定反应液中寡糖含量的变化，在酶解5h后，反应液中寡糖含量已达到最高峰。然后通过100℃水浴使酶失活，再在4℃，12000g离心30min离心获得上清液,tlc法测定结果表明上清液中成分为褐藻寡糖二糖和三糖的混合物。将上清液进行冷冻干燥后获得褐藻寡糖；计算结果表明寡糖的回收率在80％以上。

制备获得的寡糖可进一步采用凝胶柱层析方法分离获得单一的二糖和三糖。

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<110>陈艺燕

<120>一种制备褐藻寡糖的方法

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