本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的分子标记及其应用。
背景技术：
：肠球菌是一种重要的机会致病菌，在自然界中广泛分布，常栖居于人和动物的肠道中，肠球菌可导致人和动物多个脏器的感染，包括尿路感染、皮肤软组织感染、盆腔感染、腹腔感染、伤口感染、菌血症、心内膜炎和脑膜炎。肠球菌由于其细胞壁坚厚，对许多抗生素表现为固有耐药，如对β-内酰胺抗生素、氨基糖苷、氯林可霉素、氯化喹啉酮和甲氧苄氨嘧啶磺胺。由于质粒、转座子和突变株的发生，肠球菌易被诱导产生新的耐药性，对许多抗生素可产生获得性耐药，如对高水平的β-内酰胺、氨基糖苷、糖肽类、四环素、红霉素、氟化喹啉酮、利福平和氯霉素容易产生获得性耐药。近30年来，由于畜牧业将抗菌药物作为抗菌生长促进剂添加在饲料中，以增加饲料的利用率和加快动物生长，动物体内的肠球菌在抗菌药物的选择性压力作用下产生了各种耐药菌，甚至出现了多重耐药菌株。肠球菌耐药菌株的增多给临床治疗带来了较大困难。据美国波士顿哈佛大学医学院在2004年的报道，院内获得性粪肠球菌是手术后感染的主要原因，其每年可浪费数十亿美元的医疗费用。为查明动物源性粪肠球菌的耐药现状，以阻断耐药基因在不同菌株间的传播，以从动物源性食品的角度去控制耐药性的传播，现有技术中采用药敏纸片法、浓度稀释法和vitek-ams全自动药敏法，检测了临床分离的不同动物源粪肠球菌对多种抗菌药物的耐药表型；并通过采用pcr检测不同耐药基因与耐药表型之间的关系。但是上述现有技术从耐药表型着手，再对其是否携带耐药基因进行分析，该方法的使用范围具有局限性，不适合广泛检测病原菌的耐药基因。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够准确鉴定菌株耐药基因，且适用于推广应用，对于科学制定抗菌感染的防治方案及细菌耐药性的检测提供必要理论依据，本发明提供了一种用于检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的分子标记及其应用。技术方案：一种用于检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。表1分子标记序列名称序列(5，-3，)seqidno.p1-fnh2-t(10)gtgtccagaactttaccgaa1p1-rgctttgtatctccaagaacac2p2-fnh2-t(10)aactatcattaatcactagtgc3p2-rttcttctggtaccttaagtgg4p3-fnh2-t(10)gccgatgtggattgcgaaaa5p3-rgcttgatccccagtaagtca6所述分子标记在制备检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。优选的，所述试剂盒检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的粪肠球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释150～300倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。有益效果：(1)本发明所述分子标记可应用于不同动物源性的粪肠球菌庆大霉素耐药基因分析；(2)本发明所述分子标记对于科学制定抗菌感染的防治方案及细菌耐药性的检测提供必要理论依据；(3)本发明所述分子标记对有效的预防与控制粪肠球菌耐药基因在不同细菌之间的水平传播以及食源性细菌耐药基因的向人散播有着重要意义。附图说明图1是实施例1～3检测结果图；其中，1为分子量为1500bp的maker；3为实施例1pcr产物电泳结果；4为实施例2pcr产物电泳结果；5为实施例3pcr产物电泳结果。具体实施方式实施例1一种用于检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的粪肠球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释150倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例2一种用于检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的粪肠球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入40μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释250倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例3一种用于检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的粪肠球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。sequencelisting<110>苏州乔纳森新材料科技有限公司<120>一种用于检测粪肠球菌庆大霉素耐药基因的分子标记及其应用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gtgtccagaactttaccgaa20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gctttgtatctccaagaacac21<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3aactatcattaatcactagtgc22<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4ttcttctggtaccttaagtgg21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gccgatgtggattgcgaaaa20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gcttgatccccagtaagtca20当前第1页12