本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用。
背景技术：
b族链球菌学名为无乳链球菌，是一种有荚膜的细菌，能够引起牛乳房炎，危害牧业非常严重，所以早为畜医界注目。后来发现该细菌能够感染人类，尤其是新生儿。该细菌所引起的败血症、脑膜炎、肺炎等疾病的死亡率极高，并且通常伴有神经系统后遗症，由此又被医学界所重视。
b族链球菌是妇女生殖道常见的携带菌，也是妇女围产期感染、泌尿道感染、新生儿菌血症、心内膜炎等主要病原菌。目前治疗b族链球菌感染多选用β内酰胺类抗生素，对有过敏体质或轻微感染患者，常用大环内酯类抗生素替代。随着大环内酯类抗生素的使用显著增加，导致大量耐药菌株出现，我国有关b族链球菌耐药性及耐药基因谱的资料少见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够特异性检测b族链球菌耐药基因的方法，本发明提供了一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记及其应用。
技术方案：一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。
表1分子标记序列
所述分子标记在制备检测b族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
优选的，所述试剂盒检测b族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的b族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
有益效果：(1)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高、稳定性好的优点；(2)本发明所述分析标记能够有效检测耐药基因，确定造成耐药的原因，了解耐药流行株的发生、发展、传播规律，对预防和控制耐药发展起着非常重要的作用。
附图说明
图1是实施例1～3检测结果图；
其中，1为分子量为2000bp的maker；2为实施例1pcr产物电泳结果；3为实施例2pcr产物电泳结果；4为实施例3pcr产物电泳结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。
所述分子标记在制备检测b族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测b族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的b族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例2
一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。
所述分子标记在制备检测b族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测b族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的b族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释150倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
实施例3
一种用于检测b族链球菌四环素耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。
所述分子标记在制备检测b族链球菌四环素耐药基因试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。
所述试剂盒检测b族链球菌四环素耐药基因的步骤包括：
(1)取样：选取纯化后的b族链球菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；
(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；
(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；
(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。
所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。
所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。
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