一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系
背景技术：
：间充质干细胞是普遍存在于不同组织的多潜能成体干细胞，目前已经从骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、绒毛膜、蜕膜、脐带、脐血等组织中分离培养出间充质干细胞。已有研究表明间充质干细胞具有分化能力强，倍增时间短，具有免疫调节作用和低下的免疫原性，易于转染的特性，是再生医学的一种理想种子细胞和基因治疗载体，已成为干细胞临床转化应用研究的热点。目前，使用的间充质干细胞主要为骨髓间充质干细胞，其来源方便快捷，可是该来源间充质干细胞具有如下缺陷：1.在骨髓中含量低（约0.1～0.01‰），而且随着年龄增加，其扩增、分化能力和细胞数量出现明显下降趋势；2.存在伦理问题，来源受到限制；3.供者有不适感，不易接受；4.病毒感染机会大；5.异体移植的免疫排斥强。人胎盘绒毛膜间充质干细胞是一种能替代骨髓间充质干细胞,并可弥补其缺陷的间充质干细胞。人胎盘绒毛膜间充质干细胞有如下优势：1.取材几乎不受限制。胎盘为“废弃”物，只要在正常分娩的健康产妇知情同意的基础上，都能够提供胎盘。供者无痛苦，污染机会少；2.胎盘绒毛膜间充质干细胞更加原始，免疫原性更低，获得的原代间充质干细胞数量大；3.不涉及社会、伦理及法律方向的更多争论。因此人胎盘绒毛膜间充质干细胞受到再生医学领域的广泛关注。间充质干细胞是继造血干细胞之后，第二种用于临床治疗的干细胞，国外已经有7种间充质干细胞产品用于临床。我国在间充质干细胞的基础研究方面起步早，有些基础研究还处于国际领先水平，但是我国的临床转化水平不足，没有相关临床细胞产品。因此，必定激发我国科研人员和临床医师需要大量的间充质干细胞进行基础和临床转化应用研究；另一方面，间充质干细胞传代过程影响细胞质量，目前公认的最有效的细胞代数为p3～p8代间充质干细胞。如何体外简便地培养出大量原代间充质干细胞是间充质干细胞基础研究和转化应用的关键之一，也是间充质干细胞研究领域中的重要研究方向。本发明通过三次培养，提高了p0代细胞数量，为将来的研究提供材料保障，同时减少了同一研究中，使用不同批次细胞产生的差异。因此建立一种简便的能获得大量p0代细胞的人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系是亟需解决的问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，能够提高p0代细胞产量。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，包括以下步骤：（1）人胎盘绒毛膜组织处理后，进行初次培养，7天后倒置显微镜下观察培养情况，更换培养基；（2）初次培养瓶中的组织块、培养液和冲洗液离心后重新接种，进行再次培养，7天后倒置显微镜下观察培养情况，更换培养基；（3）再次培养瓶中的组织块、培养液和冲洗液离心后重新接种，进行第三次培养，7天后倒置显微镜下观察培养情况，更换培养基；（4）待三次培养细胞融合度达到80-90%时，用胰酶消化传代，即得人胎盘绒毛膜间充质干细胞。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（1）所述7天是指培养瓶置于培养箱中处于完全静止状态，不移动、不用显微镜观察和不进行培养液更换。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（1）所述更换培养基是指全量换液。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（2）所述初次培养瓶中的组织块、培养液和冲洗液是指初次培养7天后，第一次换液时，培养瓶中的组织块和培养液，以及用生理盐水冲洗培养瓶底的冲洗液。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（2）所述离心为1500r/min，5min。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（2）所述再次培养接种的培养瓶为初次培养接种培养瓶数量的一半。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（2）所述7天是指培养瓶置于培养箱中处于完全静止状态，不移动、不用显微镜观察和不进行培养液更换。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（2）所述更换培养基是指全量换液。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（3）所述再次培养瓶中的组织块、培养液和冲洗液是指再次培养7天后，第一次换液时，培养瓶中的组织块和培养液，以及用生理盐水冲洗培养瓶底的冲洗液。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（3）所述离心为1500r/min，5min。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（3）所述7天是指培养瓶置于培养箱中处于完全静止状态，不移动、不用显微镜观察和不进行培养液更换。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（3）所述第三次培养接种的培养瓶为再次培养接种培养瓶数量的一半。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养体系，其特征在于，所述步骤（3）所述更换培养基是指全量换液。根据权利要求1所述的一种人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤（4）所述胰蛋白酶消化前，先用生理盐水清洗细胞以除去培养基。本发明的培养过程中，除了接种培养的七天，每天应该用倒置显微镜观察细胞生长状态，培养基营养不够应及时补充或更换，细胞达到80-90%融合状态时，及时传代。本发明适用无血清培养基，不含血清，未引入外源动物蛋白，使培养的细胞更利于临床应用。本发明没有适用抗生素，使培养的细胞更利于后继研究和临床应用。本发明取得的优点和积极效果：1.简便：初次培养和再次培养的第一次换液时，原本废弃的组织块、培养液和冲洗液离心后重新接种培养，只要注意无菌操作即可，无需特别的处理程序。2.提高了p0代细胞的产量：经过三次培养，共获得的p0代细胞数量比仅仅进行过初次培养获得的细胞数量翻倍。有利于人胎盘绒毛膜间充质干细胞的后继研究和应用，以及人胎盘绒毛膜间充质干细胞库的建立奠定基础。3.充分利用了标本：一次标本处理，三次接种培养，三次细胞收获，提高了标本的利用率；由于目前绒毛膜间充质干细胞培养前的分离处理操作比较繁琐，阻碍了人绒毛膜间充质干细胞的基础研究和转化应用。本发明使得一次分离处理能够进行三次细胞培养，获得比初次培养翻倍的细胞数，有利于绒毛膜间充质干细胞的应用研究。附图说明图1为倒置显微镜下p3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞细胞形态图。符合国际细胞治疗学会推荐的间充质干细胞标准。图2是三次培养p3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞生长曲线的比较。三次培养获得细胞的生长曲线没有统计学差异（p＞0.05）。图3是三次培养p3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞诱导分化脂肪细胞，红油o染色阳性；成骨细胞，茜素红染色阳性。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。有用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明所述的无血清培养基购自gibco公司，货号为a10334-01。本发明所述的胰蛋白酶购自gibco公司，货号为25200056。本发明所述的胶原酶ⅱ购自ibco公司，货号为17101-015。本发明所述的细胞冻存混合液，购自wak-chemiemedicalgmbh，货号为wak-dex40-50-5。实施例1：人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养人胎盘绒毛膜组织处理后，进行初次培养，静止培养7天后，全量更换培养基，初次培养瓶中的组织块、培养液和冲洗液离心后重新接种，进行再次培养，静止培养7天后全量更换培养基；再次培养瓶中的组织块、培养液和冲洗液离心后重新接种，进行第三次培养，静止培养7天后全量更换培养基；待三次培养细胞融合度达到80-90%时，用胰酶消化传代，即得人胎盘绒毛膜间充质干细胞。初次培养、再次培养和第三次培养获得的细胞数、收获时间见表1。培养批次获得时间（d）单瓶细胞数（×106）总细胞数（×106）初次培养12.00±0.641.12±0.1511.73±2.09再次培养8.87±0.632.10±0.1611.12±1.42第三次培养12.33±0.801.04±0.162.69±0.71表1比较实施例2：人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养人胎盘绒毛膜组织处理后，进行初次培养，静止培养7天后，全量更换培养基，待培养细胞融合度达到80-90%时，用胰酶消化传代，即得人胎盘绒毛膜间充质干细胞。比较实施例3：人胎盘绒毛膜间充质干细胞培养人胎盘绒毛膜组织处理后，进行初次培养，静止培养7天后，全量更换培养基，初次培养瓶中的组织块、培养液和冲洗液离心后重新接种，进行再次培养，静止培养7天后全量更换培养基；再次培养瓶中的组织块、培养液和冲洗液离心后重新接种，进行第三次培养，静止培养7天后全量更换培养基；将第三次培养的培养基和冲洗的生理盐水，离心（1500r/min，5min）后的沉淀用于第四次接种，培养瓶的数量为初次培养的八分之一，7天后，置于倒置显微镜下观察，基本看不到有部分细胞贴壁生长，微小组织块基本悬浮于培养基中。培养至第20天，细胞未到80%融合度，生长曲线分析，明显同其他批次培养不同。共进行过5例第四次培养，到20天时，均未达到80%融合度，生长缓慢。故本专利申请的方法只进行三次接种培养。实施例4：人胎盘绒毛膜间充质干细胞的传代、冻存和复苏当培养瓶中细胞达到80-90%融合状态时，移除培养基，用生理盐水冲洗培养瓶两次，加入3ml胰蛋白酶，置于37℃培养箱中消化约3-5分钟，加入培养基15ml，终止胰酶消化作用，取100ul用于计细胞活率和细胞数。离心（1500r/min，5min）后按1:2传代接种，置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%co2的培养箱中，一般2-3天即可达到80-90%融合状态，需要再次传代。达到需要冻存的代数时，按照传代消化后，根据细胞数量，加入培养基和细胞冻存液，使得细胞浓度为1×106/ml，细胞冻存液为10%。混匀后，分装于2ml的冻存管中，转移至程序降温仪中，按照第一步降温速度为5℃/min，降到4℃，第二步降温速度为1℃/min，降到-45℃，第三步降温速度为5℃/min，降到-100℃。当温度到达-100℃，取出冻存盒，转移至-196℃液氮中。需要复温时，从液氮中取出冻存管，立即置于37-42℃水浴箱中并不断摇晃冻存管，吸取溶化后的细胞悬液于离心管中，加入5-10ml培养基，然后离心（1500r/min，5min），去除上清液，沉淀加入培养基后置于饱和湿度、37℃、体积分数为5%co2的培养箱中静止培养，第二天即可见细胞贴壁生长，细胞达到80-90%融合状态时，进行传代。实施例5：人胎盘绒毛膜间充质干细胞的生物学特性鉴定以及三次培养细胞的比较获得的间充质干细胞需要进行病原学检查，排除包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、hiv、梅毒等感染，并排除细菌、真菌和支原体等污染，另外，按照国际细胞治疗学会推荐间充质干细胞认证标准，获得的人胎盘绒毛膜间充质干细胞的cd45、cd34、、cd14、cd19和hla-dr的表达率≤2%，而cd90、cd105、cd73的表达率≥95%，成骨和成脂诱导分化检测阳性，同时比较三次培养是否存在差异，故进行如下检测：（1）人胎盘绒毛膜间充质干细胞表面标记物检测分别取三次培养至第三代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，抗体标记后进行检测。所有标本达到cd90、cd105和cd73的表达率大于95%，cd45、cd34、、cd14、cd19和hla-dr的表达率小于2%，符合国际细胞治疗学会推荐的间充质干细胞认证标准，同时，对三次培养细胞表面标记物进行比较，没有统计学差异（p＞0.05），见表2。培养批次cd34cd45cd14cd19hla-drcd73cd90cd105初次培养0.81±0.121.24±0.101.21±0.150.11±0.091.15±0.2410099.17±0.1499.71±0.09再次培养0.78±0.211.21±0.271.23±0.130.11±0.121.12±0.3110099.21±0.1899.82±0.03第三次培养0.82±0.151.10±0.141.14±0.130.10±0.111.21±0.1110098.67±0.1399.52±0.08表2（2）人胎盘绒毛膜间充质干细胞诱导分化检测分别取三次培养至第三代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，接种于24孔培养板，当细胞长到80%融合度时，换成成骨或成脂诱导培养基，培养四周后，分别用茜素红染色试剂盒或红油o染色试剂盒染色。诱导后的细胞经茜素红染色，可见红色矿化沉着物，而油红o染色可见胞浆内脂滴染成红色。说明人胎盘绒毛膜间充质干细胞在体外特定环境下具有向成骨细胞或脂肪细胞分化的潜能。三次培养的细胞均分化阳性。（3）人胎盘绒毛膜间充质干细胞生长曲线检测分别取三次培养至第三代人胎盘绒毛膜间充质干细胞接种于96孔板上，设置7组，每组7孔，置于37℃、5%co2的培养箱中培养，每隔24h，任意选择一组，加入10ulcck-8溶液，酶标仪检测各组细胞吸光度值（激发波长450nm），用无细胞的培养基做空白对照，连续7天，每天取7孔的吸光度均值绘制生长曲线。三次培养细胞的生长曲线比较没有差异（p＞0.05）。（4）人胎盘绒毛膜间充质干细胞病原学检查分别取三次培养至第三代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，用培养基吹打成单细胞悬液进行病原学检查，排除包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、hiv、梅毒等感染，并排除细菌、真菌和支原体等污染。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改造，这些变化和改造都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12