一种细胞复苏方法与流程

本发明涉及细胞培养
技术领域：
，尤其涉及一种细胞复苏方法。
背景技术：
：细胞复苏是将长期超低温冻存于液氮中的细胞，迅速解冻到常温过程，同时确保恢复细胞的活性与生物学特征。细胞冻存后复苏的往往直接影响细胞复苏的质量，关于细胞复苏的方法研究很多，专利号200510024978.2公开了一种胚胎干细胞复苏方法，申请号cn201510800480.4公布了一种脂肪间充质干细胞复苏的方法，申请号cn201510791550.4公布了一种脐带间充质干细胞复苏方法，申请号cn201510791413.0公布了一种骨髓间充质干细胞复苏方法。但是，现有的细胞复苏方法，存在步骤使用特殊仪器、复苏后细胞活率低、细胞易老化，细胞增殖能力差。技术实现要素：本发明实施例提供了一种细胞复苏方法，能够使复苏后细胞活率高、不易老化、增殖能力好，满足多种不同细胞冻存后复苏的需要。为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：本发明实施例提供一种细胞复苏方法，所述细胞复苏方法包括以下三个步骤：步骤一、将冻存的细胞取出后，放入50℃以下的恒温水中震荡温育50-60s；步骤二、获取经过步骤一处理后的细胞，经过1500rpm离心3分钟后去上清，加入无血清的dmem培养基37℃孵育2分钟，其中，所述dmem培养基中包括浓度为1-15ng/ml的bfgf；步骤三、获取经过步骤二处理后的细胞，经过800rpm离心2分钟后去上清，加入无血清的dmem/f12培养基孵育3分钟。进一步地，所述步骤一，具体包括：将冻存的细胞取出后，先放入42℃恒温水中震荡温育20秒，再放入40℃恒温水中震荡温育10秒，最后放入37℃恒温水中震荡温育20秒。进一步地，在所述步骤三执行之后，所述细胞复苏方法还包括：将所述细胞转入正常细胞培养基中贴壁培养。进一步地，所述dmem培养基中包括的bfgf的浓度为5-10ng/ml。优选的，所述dmem培养基中包括的bfgf的浓度为8ng/ml。进一步地，所述细胞为表皮干细胞、成纤维细胞、黑色素细胞、角膜细胞、脂肪干细胞或者口腔黏膜上皮细胞。进一步地，所述dmem/f12是dmem培养液和f12培养液以体积比3:1的比例混合的。本发明实施例提供一种细胞复苏方法，细胞复苏方法包括以下三个步骤：步骤一、将冻存的细胞取出后，放入50℃以下的恒温水中震荡温育50-60s；步骤二、获取经过步骤一处理后的细胞，经过1500rpm离心3分钟后去上清，加入无血清的dmem培养基37℃孵育2分钟，其中，所述dmem培养基中包括浓度为1-15ng/ml的bfgf；步骤三、获取经过步骤二处理后的细胞，经过800rpm离心2分钟后去上清，加入无血清的dmem/f12培养基孵育3分钟。基于上述实施例的描述，本发明主要是基于程序快速升温理念，现在42℃温育20s、然后是40℃10s、接着37℃20s，既能满足解冻的要求，又可保护细胞，是最佳的要求。接着，是让冻存细胞快速适应新环境，采用不用的复苏液，无血清的含1-15ng/mlbfgf的dmem培养基和无血清的dmem/f12培养基，是一种改良的方式让细胞逐渐适应。本发明所述方法可以应用于表皮干细胞、成纤维细胞、黑色素细胞、角膜细胞、脂肪干细胞、口腔黏膜上皮细胞的复苏。本发明的有益效果：复苏后的细胞活率高、细胞活性高，复苏后的细胞增殖能力好。附图说明图1为本发明实施例提供的细胞复苏方法复苏的细胞与冻存前细胞的形态的示意图；图2为本发明实施例提供的以现有常规方法复苏的细胞和以本发明实施例提供的细胞复苏方法复苏的细胞的复苏率比较图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。在细胞保存领域，一直有一种“缓冻快溶”的说法。“快溶”就是指复苏尽可能的快。但是在复苏过程，往往温度太高会造成细胞损伤，尤其是长期冻存后的细胞比较脆弱。如何在复苏的温度和解冻速率找一个平衡，是本发明的关键。本发明实施例提供一种细胞复苏方法，首先，将同等数量的表皮干细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞、口腔黏膜混入无血清商业化冻存液dmem/f12后，冰箱4℃1天、-20℃两天、-80℃3天，然后放入液氮冻存。其次，对上述放入液氮冻存6个月的表皮细胞，按照以下步骤对细胞进行复苏：步骤一、将冻存的细胞取出后，放入50℃以下的恒温水中震荡温育50-60s；步骤二、获取经过步骤一处理后的细胞，经过1500rpm离心3分钟后去上清，加入无血清的dmem培养基37℃孵育2分钟，其中，所述dmem培养基中包括浓度为1-15ng/ml的bfgf；步骤三、获取经过步骤二处理后的细胞，经过800rpm离心2分钟后去上清，加入无血清的dmem/f12培养基孵育3分钟。示例性的，本发明实施例提供的细胞复苏方法可以包括：步骤1、将冻存的细胞取出后放入42℃恒温水中震荡温育20秒、40℃恒温水中震荡温育10秒、37℃恒温水中震荡温育20秒；步骤2、将步骤1的产物1500rpm离心3分钟后去上清，加入无血清的含1、8或者15ng/mlbfgf的dmem培养基37℃孵育2分钟；或者将步骤1的产物1500rpm离心3分钟后去上清，加入无血清的含8ng/mlbfgf的dmem培养基37℃孵育2分钟；或者将步骤1的产物1500rpm离心3分钟后去上清，加入无血清的含15ng/mlbfgf的dmem培养基37℃孵育2分钟；步骤3、将步骤2的产物800rpm离心2分钟后去上清，加入无血清的dmem/f12培养基孵育3分钟。将上述步骤复苏的细胞与冻存前细胞的形态作对比，结果如图1。从图1可以看出，用本发明复苏方法复苏的细胞与冻存前细胞形态非常相近，几乎没有变化，说明本发明复苏方法对细胞起到很好地保护作用。同时，将液氮冻存6个月后的细胞以现有常规方法在42℃水域中复苏2分钟，800rpm离心2分钟后去上清，加入无血清的dmem/f12培养基孵育3分钟。将其与以本发明实施例提供的细胞复苏方法复苏的细胞的复苏率作对比，结果具体见图2。从图2可以看出，本发明提供的复苏方法，细胞的复苏率高于现有常规方法。对以现有常规方法复苏的细胞和以本发明实施例提供的细胞复苏方法复苏的细胞进行传代培养，观察细胞开始老化代次，具体结果见表1。表1本发明现有复苏方法表皮干细胞p13p7成纤维细胞p18p13脂肪干细胞p15p11黑色素细胞p16p13口腔黏膜模型p21p18通过表1，可以看出，以本发明实施例提供的细胞复苏方法复苏的细胞在复苏后开始老化代次明显要大于以现有常规方法复苏的细胞，说明本发明提供的复苏方法复苏的细胞活性或性能优于现有复苏方法的细胞。本发明实施例提供一种细胞复苏方法，细胞复苏方法包括以下三个步骤：步骤一、将冻存的细胞取出后，放入50℃以下的恒温水中震荡温育50-60s；步骤二、获取经过步骤一处理后的细胞，经过1500rpm离心3分钟后去上清，加入无血清的dmem培养基37℃孵育2分钟，其中，所述dmem培养基中包括浓度为1-15ng/ml的bfgf；步骤三、获取经过步骤二处理后的细胞，经过800rpm离心2分钟后去上清，加入无血清的dmem/f12培养基孵育3分钟。基于上述实施例的描述，复苏后的细胞活率高、细胞活性高，复苏后的细胞增殖能力好。以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12