一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法与流程

本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法。

背景技术：

化妆品通常和人体皮肤直接接触，其安全性问题备受关注，因此进行皮肤刺激性试验十分必要。传统皮肤刺激试验多采用动物进行，所消耗动物批量大、耗时长、成本高，而且存在种属差异等缺点，某些实验还会给动物造成极大的痛苦，不符合动物保护和福利的要求。随着“3r”原则的提出，国外首先开始在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。经过近20年的皮肤刺激试验体外替代方法的研究，采用体外构建的组织工程皮肤进行毒性评价的方法已逐渐被认可，欧洲替代法验证中心(europeancenterforthevalidationofalternativemethodsecvam)在2007年5月发布的“人皮肤模型用于体外皮肤刺激试验的技术标准”指南，以及在2008年11月发布的“两项体外皮肤刺激试验验证方法”声明中，均已表明组织工程皮肤可作为体外皮肤刺激试验的替代模型。

目前为止，商业化和即将商业化的组织重建皮肤模型已达30余种，包括只由表皮细胞形成的表皮模型，具有成纤维细胞真皮层和表皮层的全层皮肤模型，以及含有成纤维细胞、表皮细胞和黑色素细胞的黑色素皮肤模型等。但通过oecd认证的可用于体外皮肤刺激试验的表皮模型只有四款，包括episkin，epiderm，skinethic和labcyte。通过验证的表皮模型数量之所以如此少，主要的原因是构建地组织工程表皮的角质层分化不完全，导致模型的屏障功能较弱。

角质层是表皮的最外层，由角质细胞及包围在其周围的脂类基质组成，这些细胞间脂质主要包含神经酰胺、游离脂肪酸和胆固醇。角质层脂质在维持皮肤屏障功能，皮肤含水量、防止水分流失方面起重要作用，并对角质细胞的粘连和脱屑起调节作用。角质层脂质的组成和含量的改变都是表皮屏障功能的影响因素。现有的商业化表皮模型产品虽然在组织结构上与人类皮肤高度相似性，具有典型的基底层，棘层，颗粒层以及角质层结构，但依然存在其他缺陷，ponec等研究发现，与人类天然皮肤相比，重建表皮模型中神经酰胺的含量降低，同时游离脂肪酸的含量非常低（ponecm,boelsmae,gibbss,mommaasm.characterizationofreconstructedskinmodels.skinpharmacolapplskinphysiol.2002;15（suppl1）:4-17.）。脂质组成的差异是造成模型角质层中板层体分泌和脂质板层异常，屏障功能不完善的原因，这些缺陷导致表皮模型对受试物的通透性偏高，从而对体外安全性测试结果的准确性造成影响，对刺激性标准品的判定存在一定的误判，通过在培养液中添加脂质成分（如棕榈酸、油酸、亚油酸、花生四希酸）虽然能在一定程度上改善脂质组成异常状态，但对脂质板层精细结构的改善作用不明显。

技术实现要素：

本发明实施例提供了一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，该方法操作简便，工艺稳定，便于规模化生产，产品脂质组成类似于天然人体皮肤，屏障功能完整，方便用于检测化妆品刺激性。

为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

本发明实施例提供一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，所述方法包括如下几个步骤：

步骤一、表皮干细胞分离和大规模培养

（1）表皮干细胞分离：将人体皮肤组织置于培养皿中，加入75%酒精10ml，迅速进行冲洗，转入pbs溶液中，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，用pbs浸洗，将组织块切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml质量比为1%的dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入10ml质量比为0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，用200目不锈钢筛网过滤表皮碎片，1000rpm离心7分钟，去掉上层清液，用pbs洗涤下层细胞，然后1000rpm离心7分钟，倒掉上清液，加入表皮细胞培养液，按2-4×106/瓶接种到iv型胶原包被的培养瓶中，37℃，5%co2培养箱中孵育10-15min，吸出培养基，更换新鲜表皮细胞培养液继续培养，隔48h换一次液；

（2）大规模培养：待细胞达到80%汇合时，用胰酶消化液消化表皮干细胞，用表皮细胞培养液kc-growth重悬细胞，按0.2-0.5×105个/cm²接种到细胞工厂中，加入表皮细胞培养液，37℃培养48-72h，隔天换液；

步骤二、组织工程表皮构建

（1）表皮干细胞接种：将步骤一中获得的表皮干细胞用胰酶消化液消化，用接种培养基制成密度为1.25×106-2.5×106个/ml的表皮干细胞分散液，取200μl接种于含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，震荡均匀，在37℃，5%co2培养箱中孵育20-30min；

所述接种培养液包括：kc基础液中添加l-谷氨酰胺1.5-2.0mm/l，表皮生长因子1-10μg/l、氢化可的松10-100μg/l、胰岛素2-20mg/l、bpe25-50mg/l、氯化钙0.06-0.4mm/l，促进表皮干细胞快速均匀贴附在聚碳酸酯膜上；

（2）液下培养：将接种后的细胞培养小室转入表皮模型培养模具中，小室外的培养皿中加入新鲜表皮细胞tu培养液，37℃，5%co2培养箱继续培养24-48h；

所述表皮细胞tu培养液包括：kc基础液中添加l-谷氨酰胺1.5-2.0mm/l，表皮生长因子1-10μg/l、氢化可的松10-100μg/l、胰岛素2-20mg/l、bpe25-50mg/l、腺嘌呤10-50mg/l、转铁蛋白5-12μg/l、氯化钙0.06-0.4mm/l；

（3）气液面培养：吸去细胞小室中的剩余培养基，小室外添加表皮细胞ta培养液进行气液面培养，37℃5%co2培养箱继续培养8-12天后可得厚度为100-150μm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、角质层的组织工程表皮模型；

所述表皮细胞ta培养液包括：表皮tu培养液中添加脂质混合物和/或过氧化物酶体增殖物激活受体激活剂gw5015160.1-1mm/l、维生素c30-50μg/l，氯化钙2.0-3.0mm/l。

进一步地，所述表皮细胞培养液包括：kc基础液中添加1%l-谷氨酰胺和0.2%bpe，所述l-谷氨酰胺的浓度为1.5-2.0mm/l，所述bpe浓度为25-50mg/l。

进一步地，所述表皮模型培养模具包括：一个用于固定小室的支架和一个配套的培养皿，以保证每个小室与液面接触的高度一致。

进一步地，所述脂质混合物包括：l-丝氨酸0.5-1.0mm/l、棕榈酸8-10μm/l、亚油酸0.02-0.1mm/l、精氨琥珀酸0.05-0.1mm/l、牛血清白蛋白0.02-0.1mm/l。

本发明采用表皮干细胞作为种子细胞，细胞增殖和分化能力强，在精细调节的培养液中诱导分化形成的重组表皮组织结构与天然皮肤高度相似，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、和角质层（见附图1，从图中可以看出采用本发明中使用的构建方法获得的重组表皮模型具有与天然人体皮肤高度相似的组织学结构），功能和活性维持时间长；以无毒性、生物相容性好的聚碳酸脂膜作为支架，材料标准化程度高、产品均一性和稳定性高，而且工艺简单、生产周期短，有效降低生产成本；构建过程中采用无血清培养液，减少不明确成分对毒性试验结果的影响；气液面培养阶段，根据本模型的脂质组成特点，对培养液中添加的脂质成分和含量进行调节，如降低棕榈酸，增加亚油酸的浓度，去除油酸和花生四希酸；同时通过加入ppars激活剂过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptorppars)激活剂gw501516，协同调节表皮细胞脂质代谢，促进神经酰胺的合成和分泌，使角质层脂质组成和板层结构更接近天然皮肤，有效增强角质层的屏障功能，提高化学品判断的准确性，使模型敏感性达到100%，特异性达到80%，准确性提高到90%。

附图说明

图1为本发明实施例提供的体外重组表皮模型与天然人体皮肤组织学染色结果对比图；

图2为本发明实施例提供的体外重组表皮模型对经济合作组织测试文件439中20种皮肤刺激性标准品的判定结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。

其中，本发明实施例中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。

实施例1

本发明实施例提供一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，采用以下步骤：

1、表皮干细胞分离和大规模培养：

（1）表皮干细胞分离：将人体皮肤组织置于培养皿中，加入75%酒精10ml，迅速进行冲洗，转入pbs溶液中，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，用pbs浸洗，将组织块切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml质量比为1%的dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入10ml质量比为0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，用200目不锈钢筛网过滤表皮碎片，1000rpm离心7分钟，去掉上层清液，用pbs洗涤下层细胞，然后1000rpm离心7分钟，倒掉上清液，加入表皮细胞培养液，按2-4×106/瓶接种到iv型胶原包被的培养瓶中，37℃，5%co2培养箱中孵育10-15min，吸出培养基，更换新鲜表皮细胞培养液继续培养，隔48h换一次液。

（2）大规模培养：待细胞达到80%汇合时，用胰酶消化液消化表皮干细胞，用表皮细胞培养液kc-growth重悬细胞，按0.2-0.5×105个/cm²接种到细胞工厂中，加入表皮细胞培养液，37℃培养48-72h，隔天换液。

上述表皮细胞培养液为：kc基础液中添加1%l-谷氨酰胺和0.2%bpe，使l-谷氨酰胺浓度在1.5-2.0mm/l，bpe浓度在25-50mg/l。

2、组织工程表皮构建：

（1）表皮干细胞接种：将步骤1中获得的表皮干细胞用胰酶消化液消化，用接种培养基制成密度为1.25×106个/ml的表皮干细胞分散液，取200μl接种于含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，震荡均匀，在37℃，5%co2培养箱中孵育20-30min。

上述接种培养液为：kc基础液中添加l-谷氨酰胺1.5-2.0mm/l，表皮生长因子1-10μg/l、氢化可的松10-100μg/l、胰岛素2-20mg/l、bpe25-50mg/l、氯化钙0.06-0.4mm/l，促进表皮干细胞快速均匀贴附在聚碳酸酯膜上。

（2）液下培养：将接种后的细胞培养小室转入表皮模型培养模具中，小室外的培养皿中加入新鲜表皮细胞tu培养液，37℃，5%co2培养箱继续培养24-48h。

上述表皮模型培养模具包括：一个用于固定小室的支架和一个配套的培养皿，可以保证每个小室与液面接触的高度一致，同时方便进行换液操作，减少污染风险。

上述表皮细胞tu培养液为：kc基础液中添加l-谷氨酰胺1.5-2.0mm/l，表皮生长因子1-10μg/l、氢化可的松10-100μg/l、胰岛素2-20mg/l、bpe25-50mg/l、腺嘌呤10-50mg/l、转铁蛋白5-12μg/l、氯化钙0.06-0.4mm/l。

（3）气液面培养：吸去细胞小室中的剩余培养基，小室外添加表皮细胞ta培养液进行气液面培养，37℃5%co2培养箱继续培养8-12天后可得厚度为100-150μm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、角质层的组织工程表皮模型。

上述表皮细胞ta培养液为：表皮tu培养液中添加脂质混合物（l-丝氨酸0.5-1.0mm/l、棕榈酸8-10μm/l、亚油酸0.02-0.1mm/l、精氨琥珀酸0.05-0.1mm/l、牛血清白蛋白0.02-0.1mm/l）、维生素c30-50μg/l，调整氯化钙浓度为2.0-3.0mm/l。

实施例2

本发明实施例提供一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，采用以下步骤：

1、表皮干细胞分离和大规模培养：

（1）表皮干细胞分离：将人体皮肤组织置于培养皿中，加入75%酒精10ml，迅速进行冲洗，转入pbs溶液中，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，用pbs浸洗，将组织块切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml质量比为1%的dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入10ml质量比为0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，用200目不锈钢筛网过滤表皮碎片，1000rpm离心7分钟，去掉上层清液，用pbs洗涤下层细胞，然后1000rpm离心7分钟，倒掉上清液，加入表皮细胞培养液，按2-4×106/瓶接种到iv型胶原包被的培养瓶中，37℃，5%co2培养箱中孵育10-15min，吸出培养基，更换新鲜表皮细胞培养液继续培养，隔48h换一次液。

（2）大规模培养：待细胞达到80%汇合时，用胰酶消化液消化表皮干细胞，用表皮细胞培养液kc-growth重悬细胞，按0.2-0.5×105个/cm²接种到细胞工厂中，加入表皮细胞培养液，37℃培养48-72h，隔天换液。

上述表皮细胞培养液为：kc基础液中添加1%l-谷氨酰胺和0.2%bpe，使l-谷氨酰胺浓度在1.5-2.0mmol/l，bpe浓度在25-50mg/l。

2、组织工程表皮构建：

（1）表皮干细胞接种：将步骤1中获得的表皮干细胞用胰酶消化液消化，用接种培养基制成密度为1.25×106个/ml的表皮干细胞分散液，取200μl接种于含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，震荡均匀，在37℃，5%co2培养箱中孵育20-30min。

上述接种培养液为：kc基础液中添加l-谷氨酰胺1.5-2.0mm/l，表皮生长因子1-10μg/l、氢化可的松10-100μg/l、胰岛素2-20mg/l、bpe25-50mg/l、氯化钙0.06-0.4mm/l，促进表皮干细胞快速均匀贴附在聚碳酸酯膜上。

（2）液下培养：将接种后的细胞培养小室转入表皮模型培养模具中，小室外的培养皿中加入新鲜表皮细胞tu培养液，37℃，5%co2培养箱继续培养24-48h。

上述表皮模型培养模具包括：一个用于固定小室的支架和一个配套的培养皿，可以保证每个小室与液面接触的高度一致，同时方便进行换液操作，减少污染风险。

上述表皮细胞tu培养液为：kc基础液中添加l-谷氨酰胺1.5-2.0mm/l，表皮生长因子1-10μg/l、氢化可的松10-100μg/l、胰岛素2-20mg/l、bpe25-50mg/l、腺嘌呤10-50mg/l、转铁蛋白5-12μg/l、氯化钙0.06-0.4mm/l。

（3）气液面培养：吸去细胞小室中的剩余培养基，小室外添加表皮细胞ta培养液进行气液面培养，37℃5%co2培养箱继续培养8-12天后可得厚度为100-150μm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、角质层的组织工程表皮模型。

上述表皮细胞ta培养液为：表皮tu培养液中添加gw5015160.1-1mm/l、维生素c30-50μg/l，调整氯化钙浓度为2.0-3.0mm/l。

实施例3

本发明实施例提供一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，采用以下步骤：

1、表皮干细胞分离和大规模培养：

（1）表皮干细胞分离：将人体皮肤组织置于培养皿中，加入75%酒精10ml，迅速进行冲洗，转入pbs溶液中，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，用pbs浸洗，将组织块切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml质量比为1%的dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入10ml质量比为0.025%的edta-胰酶消化液，37℃消化10分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，用200目不锈钢筛网过滤表皮碎片，1000rpm离心7分钟，去掉上层清液，用pbs洗涤下层细胞，然后1000rpm离心7分钟，倒掉上清液，加入表皮细胞培养液，按2-4×106/瓶接种到iv型胶原包被的培养瓶中，37℃，5%co2培养箱中孵育10-15min，吸出培养基，更换新鲜表皮细胞培养液继续培养，隔48h换一次液。

（2）大规模培养：待细胞达到80%汇合时，用胰酶消化液消化表皮干细胞，用表皮细胞培养液kc-growth重悬细胞，按0.2-0.5×105个/cm²接种到细胞工厂中，加入表皮细胞培养液，37℃培养48-72h，隔天换液。

上述表皮细胞培养液为：kc基础液中添加1%l-谷氨酰胺和0.2%bpe，使l-谷氨酰胺浓度在1.5-2.0mmol/l，bpe浓度在25-50mg/l。

2、组织工程表皮构建：

（1）表皮干细胞接种：将步骤1中获得的表皮干细胞用胰酶消化液消化，用接种培养基制成密度为1.25×106个/ml的表皮干细胞分散液，取200μl接种于含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，震荡均匀，在37℃，5%co2培养箱中孵育20-30min。

上述接种培养液为：kc基础液中添加l-谷氨酰胺1.5-2.0mmol/l，表皮生长因子1-10μg/l、氢化可的松10-100μg/l、胰岛素2-20mg/l、bpe25-50mg/l、氯化钙0.06-0.4mm/l，促进表皮干细胞快速均匀贴附在聚碳酸酯膜上。

（2）液下培养：将接种后的细胞培养小室转入表皮模型培养模具中，小室外的培养皿中加入新鲜表皮细胞tu培养液，37℃，5%co2培养箱继续培养24-48h。

上述表皮模型培养模具包括：一个用于固定小室的支架和一个配套的培养皿，可以保证每个小室与液面接触的高度一致，同时方便进行换液操作，减少污染风险。

上述表皮细胞tu培养液为：kc基础液中添加l-谷氨酰胺1.5-2.0mmol/l，表皮生长因子1-10μg/l、氢化可的松10-100μg/l、胰岛素2-20mg/l、bpe25-50mg/l、腺嘌呤10-50mg/l、转铁蛋白5-12μg/l、氯化钙0.06-0.4mm/l。

（3）气液面培养：吸去细胞小室中的剩余培养基，小室外添加表皮细胞ta培养液进行气液面培养，37℃5%co2培养箱继续培养8-12天后可得厚度为100-150μm，具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、角质层的组织工程表皮模型。

上述表皮细胞ta培养液为：表皮tu培养液中添加脂质混合物（l-丝氨酸0.5-1.0mm/l、棕榈酸8-10μm/l、亚油酸0.02-0.1mm/l、精氨琥珀酸0.05-0.1mm/l、牛血清白蛋白0.02-0.1mm/l）、gw5015160.1-1mm/l、维生素c30-50μg/l，调整氯化钙浓度为2.0-3.0mm/l。

实施例4

体外重组表皮模型在评价化学物质对人体皮肤刺激性检测中的用途，其使用方法如下：

1、准备模型

以待测的化学品为实验组，杜氏酸盐缓冲溶液为阴性对照组（无刺激性），5%十二烷基硫酸钠为阳性对照组（刺激性），每组各准备3个体外重组表皮模型，每3个模型准备1个6孔板，每孔添加0.9ml的试验用培养液。

2、给药

对于液体测试物，每个表皮模型表面滴25μl液体测试物；对于半固体试剂，采用容积式吸管吸取25μl测试物滴加于模型表面；对于固体试剂，给药前，先在模型表面滴加25μl的杜氏酸盐缓冲溶液湿润表皮模型表面，用药匙（或其他合适的工具）加入约25mg称量后的受试物，轻摇模型促进固体受试物在模型表面的铺展。给药完毕后，将所有的6孔板转移到37℃、5%co2孵箱中培养30分钟时，开始洗涤程序。

3、清洗

用无菌杜氏磷酸缓冲液冲洗表皮模型的表面，清洗结束后，将体外重组人体皮肤表皮模型浸没于150ml杜氏磷酸盐缓冲溶液中并振摇以除去残余的测试化学品，重复浸洗3次。无菌吸水纸轻轻吸去残留的液体。然后将体外重组人体皮肤表皮模型转移到新的6孔板里（已加过培养液）。

阴性对照组和阳性对照组操作同上。

4、给药后孵育

清洗结束后，将所有的6孔板转移到37℃、5%co2孵箱中培养24h。之后将所有培养板从细胞培养箱中取出，转移到无菌工作台中，更换无血清表皮细胞培养液，每孔0.9ml。继续于37±1℃、5±1%co2、95%相对湿度培养条件下培养18h后，开始进行化学品刺激性判定。

5、化学品刺激性判定

从细胞培养箱中取出体外重组人体皮肤表皮模型，转移到含有1mg/ml噻唑蓝溶液的24孔板中，每孔0.3ml，在37℃、5%co2细胞培养箱中避光孵育3小时后，用移液器吸除噻唑蓝溶液，每孔加入2ml异丙醇使模型被完全浸没，用封口膜密封，在4℃静置提取12～16小时，得到异丙醇的浸提物。刺穿培养小室底部，使小室中液体流到培养孔中，吸取200μl的异丙醇浸提物到96孔板中，用96孔板分光光度计检测在波长为550～570nm的吸光度od值。

判定刺激性：以阴性对照组的吸光度值为分母，实验组的吸光度od值为分子，比值的百分数作为实验组的相对细胞活力，计算化学品的相对细胞活力，相对细胞活力高于50%，被检测化学品无皮肤刺激性，相对细胞活力低于50%，被检测化学品具有皮肤刺激性。

被检测化学品和皮肤刺激性检测结果见表1。

参见图2，可以看出，使用本发明构建的重组表皮模型进行20种皮肤刺激性标准品的测试结果，测试结果表明本发明构建的重组表皮模型明显提高了化学品皮肤刺激性测试的准确性，使测试准确性达到90%。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。