一种一步逆转录RT‑qPCR人MTHFR与MTRR基因多态性表达的检测试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，是一种体外诊断试剂，具体是指一种一步逆转录rt-qpcr人mthfr与mtrr基因多态性表达的检测试剂盒。
背景技术：
：亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolatereductase，mthfr)是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶，与甲硫氨酸合成酶还原酶(methioninesynthasereductase，mtrr)一起，维持叶酸正常代谢。另外，mthfr还参与维持体内正常的同型半胱氨酸水平。体内mthfr和mtrr基因突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症(hcy)。对于mthfr和mtrr基因异常的人，mthfr和mtrr酶活性明显降低，造成叶酸代谢障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高，这类人需要补充更多的叶酸，以及用更长的周期补充叶酸才能达到预期的效果。此外，mthfr和mtrr基因异常易出现高同型半胱氨酸血症(hcy)，早期进行基因检测有利于预防高同型半胱氨酸血症(hcy)及心脑血管疾病。因此，及时、准确地检测到人体mthfr和mtrr基因异常对于指导备孕妇女如何有效补充叶酸，防止胎儿畸形，以及在人类预防hcy、心脑血管疾病等方面具有至关重要的意义。目前，人体mthfr与mtrr基因多态性和多态性表达的检测具有以下几种方法：1.dna直接测序法；2.dna-pcr-sscp(聚合酶链式反应-单链构象多态性分析)；3.dna-高分辨率熔解曲线分析技术(hrm)；4.dna-反向点杂交法；5.dna-实时荧光pcr法；6.rna-实时荧光pcr法。1.dna直接测序法dna直接测序法是进行叶酸代谢基因突变检测最直接最准确的方法，是检测未知的地贫突变基因的关键方法。但其需要对样品进行扩增、纯化、序列分析，所需的时间长，成本高，对取材和技术的要求都比较高，最重要的是限制灵敏度不高，对环境和操作者有危害。因此在临床应用上具有一定的限制。2.dna-pcr-sscp(聚合酶链式反应-单链构象多态性分析)pcr-sscp是一种比较经典的基因突变检测方法，是一种定性检测基因突变的方法，可以对未知的突变进行检测。具有快速、简便、灵敏和经济的特点，受到广大研究者的青睐。但其也有一定的缺陷，电泳时间较长，操作步骤繁琐，只能进行定性分析，需要平行的标准对照。3.dna-高分辨率熔解曲线分析技术(hrm)利用不同长度或不同碱基组成的dna序列熔解曲线不同，在pcr后直接运行高分辨熔解进行样品突变分析，能够区分不同突变位点与不同基因型，但是hrm对仪器要求较高，受到仪器使用的限制。4.dna-反向点杂交法反向点杂交法(rdb)是目前国内外最常用的技术，其优点在于一张杂交膜上可同时筛查多种点突变或者基因型，它的缺点也很明显，由于需要开盖进行后续处理，操作繁琐，实验时间长，实验室也很容易受到气溶胶的污染。5.dna-实时荧光pcr法实时荧光pcr技术是在常规的pcr基础上加入了荧光标记探针或相应的荧光染料来实现定量或定性的功能。它摆脱了凝胶电泳技术，避免了有毒操作，操作简便。实时荧光pcr检测叶酸代谢基因突变，不需要检基因组dna的具体含量，仅需检测样本是否具有信号即可，这使得整个过程更加简便，费用更低，而且pcr反应具有核酸扩增的高效性，即使只有微量的基因也可以检测出来，从而使它具有很高的灵敏度。目前多数人mthfr与mtrr基因多态性检测试剂采用实时荧光pcr法进行检测，具有灵敏度高和特异性好的优点。但是dna-实时荧光pcr法针对的是mthfr与mtrr的dna序列，而不是针对发挥功能的rna，并且dna的合成产物不仅仅包括翻译区的外显子，还包括非编码区的内含子序列，因此该方法缺少检测的特异性。6.rna-实时荧光pcr法rna-实时荧光pcr法是针对rna进行检测，目前针对基因组表达rna的检测需要通过逆转录将rna逆转录为cdna,然后对cdna进行实时荧光pcr检测。该操作方法繁琐，需要两步反应，同时需要对cdna进行稀释后才能进行后续的实时荧光pcr反应，稀释过程容易产生气溶胶，造成实验室的大面积污染。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明以药物代谢的遗传学为基础，在利用实时荧光pcr探针技术高灵敏度和高特异性的优点的基础上，针对mthfr与mtrr的rna序列，能够直接对表达区域的翻译产物进行检测，与现有dna-实时荧光pcr法相比，更接近于是否有表达蛋白质(即亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶)的检测，检测结果更具有特异性。为实现上述目的，本发明提供了一种一步逆转录rt-qpcr人mthfr与mtrr基因多态性表达的检测试剂盒，包括mthfr-c677t反应缓冲液、mthfr-a1298c反应缓冲液、mtrr-a66g反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、onestep酶混合液。优选的，所述检测试剂盒包括1支800μlmthfr-c677t反应缓冲液、1支800μlmthfr-a1298c反应缓冲液、1支800μlmtrr-a66g反应缓冲液、1支50μl阳性对照、1支50μl阴性对照、1支50μlonestep酶混合液。进一步的，所述mthfr-c677t反应缓冲液包括onesteprt-qpcrreactionbuffer、rt增强剂、dntps、c677t特异性上下游引物、c677t特异性探针；所述mthfr-a1298c反应缓冲液包括onesteprt-qpcrreactionbuffer、rt增强剂、dntps、a1298c特异性上下游引物、a1298c特异性探针；所述mtrr-a66g反应缓冲液包括onesteprt-qpcrreactionbuffer、rt增强剂、dntps、a66g特异性上下游引物、a66g特异性探针。进一步的，所述c677t特异性上下游引物为mthfr-c677t-l、mthfr-c677t-r；所述c677t特异性探针为mthfr-c677t-p-w、mthfr-c677t-p-m。进一步的，所述a1298c特异性上下游引物为mthfr-a1298c-l、mthfr-a1298c-r；所述a1298c特异性探针为mthfr-a1298c-p-w、mthfr-a1298c-p-m。(相关碱基序列见表2)进一步的，所述a66g特异性上下游引物为mtrr-a66g-l、mtrr-a66g-r；所述a66g特异性探针为mtrr-a66g-p-w、mtrr-a66g-p-m。(相关碱基序列见表2)进一步的，所述阳性对照是人基因组dna、突变质粒；所述阴性对照是生理盐水。进一步的，所述onestep酶混合液是taq酶、m-mlv酶、rnasininhibitor、酶稳定剂的混合液。本发明还提供一种上述的检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)rna提取；(2)试剂准备和加样；(3)上机检测，进行pcr扩增及荧光采集；(4)检验结果的解释。优选的，本发明所述pcr扩增及荧光采集相关参数设置为：逆转录50℃30min；预变性95℃5min；pcr95℃15s；60℃40s；循环5次；95℃15s；60℃40s；循环30次。本发明能够定性检测叶酸代谢相关基因的3个snp位点(mthfr基因c677t位点、mthfr基因a1298c位点和mtrr基因a66g位点)的6种基因型的rna，共3支反应缓冲液，每个反应管检测两种基因型rna，通过两个不同的荧光通道读取信息。基因型rna检测情况由fam、hex指示，内参基因β-actinrna由rox指示，对mthfr基因和mtrr基因的不同基因型进行特异性检测，为临床检验提供实验室辅助诊断的依据。本发明的试剂盒配合使用rna提取试剂(磁珠法)提取全血基因组rna。本发明最优选的方案见表1所列成分，所设计的探针、引物及其序列见表2。表1本发明试剂盒最优选的成分组成表以上成分中，onesteprt-qpcrreactionbuffer、rt增强剂和onestep酶混合液三者构成了本发明的onestepqrt-qpcrsystem。该系统由酶系统和buffer系统组成，具体包括：(1)酶系统：taq酶、m-mlv酶、rnasininhibitor、酶稳定剂(50mmtris-hclph7.0、1mmedta、1％triton、50％甘油)；(2)buffer系统：onesteprt-qpcrreactionbuffer(20mmtris-hclph8.2、50mm氯化钾、1.5mm镁离子)、rt增强剂(5％甲酰胺、0.5％bsa)。表2本发明探针、引物序列表此外，本发明采用kingnova-ringprobe设计技术，使检测所用探针形成稳定ring结构：mthfr-c677t-p-w的ring结构如图1所示；mthfr-c677t-p-m的ring结构如图2所示；mthfr-a1298c-p-w的ring结构如图3所示；mthfr-a1298c-p-m的ring结构如图4所示；mtrr-a66g-p-w的ring结构如图5所示；mtrr-a66g-p-m的ring结构如图6所示。本发明的有益效果在于：1.本发明用于检测叶酸代谢相关基因多态性，以乙二胺四乙酸(edta)抗凝全血为检测样本，以rna作为检测靶基因，为临床个体化补充叶酸提供依据。2.和现有人mthfr与mtrr基因多态性检测方法对比，本发明检测叶酸代谢相关基因(mthfr基因位点c677t、mthfr基因a1298c位点和mtrr基因a66g位点)的3个snp位点的6种基因型的rna，与亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶的酶活缺陷更具有相关性，检测结果更具有特异性。3.与现有rna检测步骤(将rna转录为cdna；通过实时荧光pcr技术检测cdna)相比。本发明通过onestepqrt-qpcrsystem的改造，在一个扩增管中实现实时荧光法直接检测叶酸代谢相关基因的3个snp位点(mthfr基因c677t位点、mthfr基因a1298c位点和mtrr基因a66g位点)的6种基因型的rna，检测结果方便快捷，同时无需开盖处理，有效避免实验室污染。4.和普通探针相比，kingnova-ringprobe设计技术，使检测所用探针形成稳定ring结构，有利于探针稳定性。5.和普通探针相比，kingnova-ringprobe设计技术结合lna基团标记技术，特异性结合的snp位点，能够有效区分纯合子和杂合子，不会出现非特异扩增和假阳性结果，具有检测特异性。6.和普通探针相比，kingnova-ringprobe设计技术是单一结构，能够更好的结合靶基因，具有更高的检测灵敏度。附图说明图1是mthfr-c677t-p-w的ring结构；图2是mthfr-c677t-p-m的ring结构；图3是mthfr-a1298c-p-w的ring结构；图4是mthfr-a1298c-p-m的ring结构；图5是mtrr-a66g-p-w的ring结构；图6是mtrr-a66g-p-m的ring结构；图7-9是阳性对照检测结果扩增曲线图，其中：图7是阳性对照mthfr-677ct杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图；图8是阳性对照mthfr-1298ac杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图；图9是阳性对照mtrr-66ag杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图；图10-12是阴性对照检测结果扩增曲线图，其中：图10是阴性对照mthfr-677cc纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图；图11是阴性对照mthfr-1298aa纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图；图12是阴性对照mtrr-66aa纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图；图13-21是待测样本检测结果扩增曲线图，其中：图13是待测样本mtrr-677cc纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图；图14是待测样本mtrr-677ct杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图；图15是待测样本mtrr-677tt纯合基因型-突变子的检测结果扩增曲线图；图16是待测样本mthfr-1298aa纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图；图17是待测样本mthfr-1298ac杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图；图18是待测样本mthfr-1298cc纯合基因型-突变子的检测结果扩增曲线图；图19是待测样本mtrr-66aa纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图；图20是待测样本mtrr-66ag杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图；图21是待测样本mtrr-66gg纯合基因型-突变子的检测结果扩增曲线图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。结合附图7-21，本发明的最佳实施方式如下：1.样本临床备孕女性血液样本10份，分别标注为：叶酸代谢01、叶酸代谢02、叶酸代谢03、叶酸代谢04、叶酸代谢05、叶酸代谢06、叶酸代谢07、叶酸代谢08、叶酸代谢09、叶酸代谢10，阳性对照1份，阴性对照1份。2.试剂准备(试剂准备区)(1)实验前20分钟从冰箱中取出本发明试剂盒里的相应试剂，平衡至室温，涡旋混匀后，于2000rpm离心10s。(2)每份样本需要进行3管pcr反应以检测3个snp位点(mthfr基因c677t位点、mthfr基因a1298c位点和mtrr基因a66g位点)。按同一份样本mthfr-c677t反应缓冲液、mthfr-a1298c反应缓冲液、mtrr-a66g反应缓冲液的顺序，向对应的pcr反应管中加入35μl/管的mthfr-c677t反应缓冲液、mthfr-a1298c反应缓冲液、mthfr-a66g反应缓冲液。应当注意的是，本发明需要根据当次实验所需要的标本数量及对照品数量决定pcr反应液配制的数量。(3)盖好pcr反应管盖，将实验所需的pcr反应管转移至样本准备区。(4)剩余试剂放回-18℃冰箱冷冻保存。3.样本准备(样本准备区)(1)rna提取：本发明配套使用rna提取试剂盒(磁珠法)进行rna提取：使用提取试剂盒说明书中规定的dna酶处理方法。(2)rna浓度检测：使用微量分光光度计，选择260nm和280nm波长检测所提取标本dna浓度与纯度，浓度要求大于30ng/μl。本发明要求纯度od260/od280为1.90～2.00之间，若超出范围需要重新提取至符合要求。(3)加样：本实验应将对照品和样本同时进行pcr检测。a.取出已分装好pcr反应液的pcr反应管，使用离心甩液器离心10s，以去除管壁附着液体。b.按同一份样本mthfr-c677t反应缓冲液、mthfr-a1298c反应缓冲液、mtrr-a66g的顺序，分别向对应pcr反应管中加入5μlrna。每次实验均需同时进行对照品rna的检测。c.盖好pcr反应管盖，离心10s以去除管壁附着液体。d.将已加入rna模板的pcr反应管转移到核酸扩增区进行上机检测。4.检测及分析(核酸扩增区)(1)将仪器开机，并进行仪器性能自检。(2)取样本准备区传递的pcr反应管，放置在仪器样品槽相应位置，核查pcr反应管摆放顺序并记录。按下表设置仪器核酸扩增及荧光采集相关参数：(3)运行反应程序。(4)待程序运行完毕后，使用软件对结果进行分析。5.检验结果的解释(1)阴性对照反应孔的三个通道(fam、hex、rox)应无扩增曲线，阳性对照反应孔的三个通道(fam、hex、rox)应均有扩增曲线，否则该次实验视为无效。待测样本反应孔的内参通道(rox)应有扩增曲线，否则该次实验视为无效。(2)按照以下标准对叶酸代谢酶相关基因多态性检测结果进行判断：(3)检测结果图7是阳性对照mthfr-677ct杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图8是阳性对照mthfr-1298ac杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图9是阳性对照mtrr-66ag杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图10是阴性对照mthfr-677cc纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值＞27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图11是阴性对照mthfr-1298aa纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值＞27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图12是阴性对照mtrr-66aa纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值＞27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图13是待测样本mtrr-677cc纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值＞27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图14是待测样本mtrr-677ct杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图15是待测样本mtrr-677tt纯合基因型-突变子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值＞27、rox通道ct值≤27；图16是待测样本mthfr-1298aa纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值＞27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图17是待测样本mthfr-1298ac杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图18是待测样本mthfr-1298cc纯合基因型-突变子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值＞27、rox通道ct值≤27；图19是待测样本mtrr-66aa纯合基因型-野生型的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值＞27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图20是待测样本mtrr-66ag杂合基因型-杂合子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值≤27、rox通道ct值≤27；图21是待测样本mtrr-66gg纯合基因型-突变子的检测结果扩增曲线图，其中，fam通道ct值≤27、hex通道ct值＞27、rox通道ct值≤27。(4)检测结果说明基因位点基因型mthfrc677tcc(正常)ct(较差)tt(风险)mthfra1298caa(正常)ac(较差)cc(风险)mtrra66gaa(正常)ag(较差)gg(风险)(5)叶酸补充建议(6)预防hcy和心脑血管疾病建议使用本发明可以及时、准确地检测到人体mthfr和mtrr基因异常，对于指导备孕妇女如何有效补充叶酸，防止胎儿畸形具有相当重要的意义。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。序列表<110>厦门金诺威生物科技有限公司<120>一种一步逆转录rt-qpcr人mthfr与mtrr基因多态性表达的检测试剂盒<130>jnws17001i<160>20<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工合成<400>1ggctgacctgaagcactt18<210>2<211>19<212>dna<213>人工合成<400>2aaagcggaagaatgtgtca19<210>3<211>12<212>dna<213>人工合成<400>3tgatgaaatcgg12<210>4<211>15<212>dna<213>人工合成<400>4ctcccttttttgagc15<210>5<211>7<212>dna<213>人工合成<400>5aaatcga7<210>6<211>20<212>dna<213>人工合成<400>6ctcccgcagttttttggagt20<210>7<211>16<212>dna<213>人工合成<400>7tgctgaagatgtgggg16<210>8<211>19<212>dna<213>人工合成<400>8ctttgtgaccattccggtt19<210>9<211>13<212>dna<213>人工合成<400>9tgaccagtgaaga13<210>10<211>18<212>dna<213>人工合成<400>10aagtgtcttttttctttc18<210>11<211>10<212>dna<213>人工合成<400>11ccagtgaagc10<210>12<211>20<212>dna<213>人工合成<400>12aagtgtcttttttttcttgc20<210>13<211>16<212>dna<213>人工合成<400>13cacagcagggacaggc16<210>14<211>21<212>dna<213>人工合成<400>14ggctctaaccttatcggattc21<210>15<211>14<212>dna<213>人工合成<400>15tcgcagaagaaata14<210>16<211>17<212>dna<213>人工合成<400>16tgtgagaaaaaacacat17<210>17<211>31<212>dna<213>人工合成<400>17cagaagaaatgtgtgagcaattttttcacac31<210>18<211>19<212>dna<213>人工合成<400>18ccgggacctgactgactac19<210>19<211>19<212>dna<213>人工合成<400>19cgacgtagcacagcttctc19<210>20<211>19<212>dna<213>人工合成<400>20cggctacagcttcaccacc19当前第1页12