本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种乙烯基改性鱼鳞蛋白膜及其制备方法。
背景技术：
目前，胶原蛋白生产提取的主要来源于三类物质：骨胶原、深海鱼鱼皮、鱼鳞。其中骨胶原主要来自猪、牛、羊等动物，原料易获取，原料源稳定，但是动物骨提取的骨胶原含有较多脂肪，骨胶原纯度稍低，美容性能稍差，并且由于宗教和动物疾病的原因，动物骨胶原的市场份额已经越来越小。相对于骨胶原，鱼皮胶原，鱼鳞胶原兼具二者的优势；并且通过检测，鱼鳞胶原蛋白的羟脯氨酸含量高于其他原料，由于鱼鳞中胶原蛋白与人皮肤胶原的结构相似，兼容性好，由鱼鳞制备的胶原蛋白产品，更容易被皮肤吸收。
对于胶原蛋白膜，国内和国外的成型方法有很多种。国内的大部分研究都采用浇铸成膜的方法，而国外则较多采用机械挤出的方法。马春辉等研究认为，较为理想的制备胶原蛋白膜的工艺条件为：配制4.5％的胶原蛋白溶→依次加入0.4％淀粉、0.25％戊二醛、0.25％增塑剂增稠→真空脱气→涂布于光滑玻璃板上→干燥→揭膜。罗爱平等认为，用甘油、氯化钙作交联剂对于增强胶原蛋白膜的柔韧性、机械性能更佳，制膜工艺为：12％胶原蛋白溶液→热处理(70～100℃，15min)→加入甘油、钙交联剂→溶解、混合→过滤→增稠→真空脱气→涂布→烘干(60～70℃，5h)→叠加类脂层→再干燥→揭膜→乙醇溶液挥发处理→自然干燥。国外与国内的成形方法则显著不同，其操作要点为：酸溶胀真皮层→研磨成浆料→过滤、均化→挤出→凝聚→鞣制→增塑→干燥→成膜。这种方法虽然赋予了胶原蛋白膜机械强度，但同时这种优良机械强度的胶原蛋白膜制备过程相对复杂，其中需要设备也较多。卢黄华等人用草鱼的鱼鳞中提取胶原蛋白，采用浇注成膜法制作胶原蛋白膜，具体实施步骤为：将鱼鳞胶原蛋白制成2％胶原蛋白水溶液和2％壳聚糖(脱乙酰度不小于90.0％)水溶液按不同质量比混合均匀，同时调节成膜条件，在冷冻高速离心机中800r/min高速搅拌10min。采用倾注法将配制好并经过真空脱气的成膜液水平放置于塑料圆盘中，经古风干燥后接膜即为样品，样品置于干燥器中保存备用。其试验验证得到：在成膜温度为45℃，ph为5、胶原蛋白与壳聚糖的配比6：4时所制备的鱼鳞胶胶原蛋白膜性能最好，抗张强度61.27mpa，断裂伸长率为5.17％。
综上，现有技术中的鱼鳞胶原蛋白膜的制备工艺繁琐，成本高，而采用简单工艺制备得到的鱼鳞胶胶原蛋白膜的机械性能差，不能满足需要。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种乙烯基改性鱼鳞蛋白膜的制备方法，本发明通过紫外光照乙烯基胶原蛋白成膜，成功地制备一种机械性能优异的胶原蛋白膜，该工艺简单、对环境无害，具有较好的经济效益和社会效益。
为解决上述问题，本发明提供了一种乙烯基改性鱼鳞蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鱼鳞胶原蛋白溶解于酸性溶液中，得胶原蛋白溶液；
(2)在水浴条件下将甲基丙烯酸酐滴加到胶原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺转氨酶，在50～60℃下反应2～8h，得到乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液；
(3)向步骤(2)的乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液中加入光引发剂，在40～60℃下超声波震荡10～30min，混合均匀后，将溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交联仪中，用紫外光进行光照1～7h交联成膜，取出自然晾干，得乙烯基改性鱼鳞蛋白膜。
为了加入鱼鳞胶原蛋白的溶解速率，首先将鱼鳞胶原蛋白肽溶解于酸性溶液中，但是如果酸性溶液的ph值过低，则会对胶原蛋白造成破坏，为了为后续反应提供温和的反应环境，优选的，在步骤(1)中，所述酸性溶液为酸性缓冲液，所述酸性缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种。
根据本发明，甲基丙烯酸酐在加热的条件下可以和胶原蛋白中的赖氨酸残基中伯氨-nh2发生反应生成酰胺键，使甲基丙烯酸酐中的c＝c引入到胶原蛋白结构中。甲基丙烯酸酐用量的多少直接关系到接枝后c＝c双键数目的多少，甲基丙烯酸酐用量太少，在胶原蛋白表面接枝形成的c＝c双键数目就少，不会再胶原蛋白间形成交联作用。一般情况下反应时间和反应温度之间是有交互作用的，温度高分子运动加快，反应效率提升，反应时间缩短；温度低分子运动减慢，反应效率降低，反应时间增长，优选的，在步骤(2)中，所述甲基丙烯酸酐与所述胶原蛋白的质量比为1：(2～15)；优选为1：(5～12)。
谷氨酰胺转氨酶可催化蛋白质分子内的交联与分子间的交联，改善胶原蛋白的凝胶能力；优选的，所述谷氨酰胺转氨酶与所述胶原蛋白的质量比为(0.01～0.05)：1。
根据本发明，光引发剂能够使茶氨酸与鱼鳞蛋白肽在光照情况下，发生反应，优选的，所述光引发剂为安息香及其衍生物、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、硫杂蒽酮类、苯甲酮类等中的至少一种。
优选的，所述光引发剂的在混合体系中的浓度为0.005～0.03％。
乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液在光引发剂的存在下能够在紫外线下能够发生交联反应，优选的，在步骤(2)中，所述紫外灯的功率密度为50～100μw/cm2，紫外线的波长为253.7～365nm。
所述鱼鳞胶原蛋白的制备工艺，包括以下步骤：
a、取鱼鳞，洗净后，将鱼鳞在含有碳酸盐的溶液中浸泡3～5h，然后将鱼鳞置于酸性溶液中，用微波处理，然后再用碱性溶液浸泡3～12h，然后洗涤至中性，过滤，得到滤液1和滤渣1；
b、将步骤a中的滤渣用酶制剂处理，洗涤过滤，得到滤液2和滤渣2；
c、将滤液1和滤液2合并，用微孔滤膜过滤，得到滤液3，对滤液3进行喷雾干燥，得到鱼鳞胶原蛋白。
根据本发明，本发明首先将鱼鳞用碳酸盐的溶液处理，碳酸盐溶液能够疏松鱼鳞中致密的胶原蛋白纤维，从而方便后续处理，提高后续处理的效率，优选的，所述含有碳酸盐的溶液为碳酸盐的水溶液，优选为碳酸钠和或碳酸钾的水溶液。
根据本发明，在步骤a中，所述酸性溶液为ph至小于7的任何溶剂，可以为酸的水溶液、强酸弱碱盐的水溶液、苯酚及其衍生物溶液，优选为酸的水溶液，由于本发明中提取的胶原蛋白最终是制作成面膜，敷在脸上，所述酸优选为对人体无害的酸，优选为浓度小于0.1m盐酸、柠檬酸、醋酸、乳酸中的至少一种。
根据本发明，微波处理能够使胶原蛋白的三螺旋结构被破坏，其中的氢键和疏水键断裂，能够增加酸溶解的效率，优选的，在步骤a中，所述微波处理的功率为400～900w；所述微波处理的时间为0.5～15min。
优选的，在步骤a中，所述碱性溶液为碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物的水溶液。
优选的，在步骤b中，所述酶制剂处理的具体步骤为：在步骤a中的滤渣中加15～20倍量水，调节控制ph值在6.5～7.5、温度在45～55℃，加入酶制剂1，该酶制剂1与滤渣比例为(0.5～3.0)∶100，搅拌0.5～1.5h，保温1～4h，然后灭活酶制剂1；控制ph值在1.0～3.0、温度在55～70℃下加入酶制剂2，该酶制剂2与滤渣比例为(0.1～3.0)∶100，搅拌1～3h后，灭活酶制剂2。
在步骤b中，所述酶制剂1和酶制剂2各自为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶中的至少一种。
本发明通过微孔滤膜过滤能够除去溶液中的大分子，优选的，在步骤c中，所述微孔滤膜为孔径为20-50μm的混合纤维素微孔滤膜。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：本发明通过甲基丙烯酸酐对鱼鳞胶原蛋白进行改性，形成了机械性能较好的乙烯基胶原蛋白膜，使得碳碳双键接枝在胶原蛋白的分子链上，进而交联在胶原蛋白表面形成致密的结构，提高了胶原蛋白膜的机械性能。且本发明工艺简单，改性效果好，制备的改性鱼皮胶原蛋白用于食品、药品和化妆品领域包装膜的制作。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供了一种乙烯基改性鱼鳞蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鱼鳞依次用碳酸钠溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液溶液中、氢氧化钠溶液和酶制剂处理，将酸处理和碱处理后的加入17倍量水中，调节控制ph值在7、温度在50℃，加入中性蛋白酶，该中性蛋白酶与滤渣比例为2.3∶100，搅拌1h，保温2h，然后灭活中性蛋白酶；控制ph值在2、温度在60℃下加入木瓜蛋白酶，该木瓜蛋白酶与滤渣比例为2.3∶100，搅拌2h后，灭活木瓜蛋白酶，过滤干燥后，即得到鱼鳞胶原蛋白。将鱼鳞胶原蛋白溶解于磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，得胶原蛋白溶液；
(2)在水浴条件下将甲基丙烯酸酐滴加到胶原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺转氨酶，在55℃下反应6h，得到乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液；
所述甲基丙烯酸酐与所述胶原蛋白的质量比为1：10；所述谷氨酰胺转氨酶与所述胶原蛋白的质量比为0.03：1；
(3)向步骤(2)的乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液中加入安息香及其衍生物光引发剂，所述安息香及其衍生物光引发剂的在混合体系中的浓度为0.009％，在50℃下超声波震荡20min，混合均匀后，将溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交联仪中，用紫外光进行光照4h交联成膜，所述紫外灯的功率密度为60μw/cm2，紫外线的波长为287.3nm，取出自然晾干，得乙烯基改性鱼鳞蛋白膜。
实施例2
本发明提供了一种乙烯基改性鱼鳞蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鱼鳞依次用碳酸钾溶液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中、氢氧化钾溶液和酶制剂处理，将酸处理和碱处理后的加入15倍量水中，调节控制ph值在6.5、温度在45℃，加入木瓜蛋白酶，该木瓜蛋白酶与滤渣比例为0.6∶100，搅拌0.5h，保温1h，然后灭活木瓜蛋白酶；控制ph值在1.0、温度在55℃下加入胰蛋白酶，该胰蛋白酶与滤渣比例为0.4∶100，搅拌2h后，灭活胰蛋白酶，过滤干燥后，即得到鱼鳞胶原蛋白。
将鱼鳞胶原蛋白溶解于磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中，得胶原蛋白溶液；
(2)在水浴条件下将甲基丙烯酸酐滴加到胶原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺转氨酶，在50℃下反应2h，得到乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液；
所述甲基丙烯酸酐与所述胶原蛋白的质量比为1：4；所述谷氨酰胺转氨酶与所述胶原蛋白的质量比为0.05：1；
(3)向步骤(2)的乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液中加入光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，所述光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的在混合体系中的浓度为0.005％，在40℃下超声波震荡10min，混合均匀后，将溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交联仪中，用紫外光进行光照1h交联成膜，所述紫外灯的功率密度为50μw/cm2，紫外线的波长为253.7nm，取出自然晾干，得乙烯基改性鱼鳞蛋白膜。
实施例3
本发明提供了一种乙烯基改性鱼鳞蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鱼鳞依次用碳酸钠溶液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中、氢氧化钠溶液和酶制剂处理，将酸处理和碱处理后的加入16倍量水中，调节控制ph值在7.1、温度在52℃，加入中性蛋白酶，该中性蛋白酶1与滤渣比例为2.4∶100，搅拌1.2h，保温4h，然后灭活中性蛋白酶；控制ph值在2.5、温度在60℃下加入胃蛋白酶，该胃蛋白酶与滤渣比例为1.2∶100，搅拌2h后，灭活胃蛋白酶，过滤干燥后，即得到鱼鳞胶原蛋白。
将鱼鳞胶原蛋白溶解于柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液中，得胶原蛋白溶液；
(2)在水浴条件下将甲基丙烯酸酐滴加到胶原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺转氨酶，在60℃下反应4h，得到乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液；
所述甲基丙烯酸酐与所述胶原蛋白的质量比为1：4；
(3)向步骤(2)的乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液中加入光引发剂硫杂蒽酮类，所述光引发剂硫杂蒽酮类的在混合体系中的浓度为0.03％，在60℃下超声波震荡30min，混合均匀后，将溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交联仪中，用紫外光进行光照7h交联成膜，所述紫外灯的功率密度为100μw/cm2，紫外线的波长为365nm，取出自然晾干，得乙烯基改性鱼鳞蛋白膜。
实施例4
本发明提供了一种乙烯基改性鱼鳞蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鱼鳞依次用碳酸钾溶液、邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液中、氢氧化钾溶液和酶制剂处理，将酸处理和碱处理后的加入17倍量水中，调节控制ph值在6.8、温度在52℃，加入中性蛋白酶，该中性蛋白酶与滤渣比例为2.3∶100，搅拌1h，保温2h，然后灭活中性蛋白酶；控制ph值在2.6、温度在65℃下加入木瓜蛋白酶，该木瓜蛋白酶与滤渣比例为1.4∶100，搅拌2h后，灭活木瓜蛋白酶，过滤干燥后，即得到鱼鳞胶原蛋白。将鱼鳞胶原蛋白溶解于邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液中，得胶原蛋白溶液；
(2)在水浴条件下将甲基丙烯酸酐滴加到胶原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺转氨酶，在52℃下反应3h，得到乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液；
所述谷氨酰胺转氨酶与所述胶原蛋白的质量比为0.03：1；
(3)向步骤(2)的乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液中加入硫杂蒽酮类光引发剂，所述硫杂蒽酮类光引发剂的在混合体系中的浓度为0.006％，在45℃下超声波震荡15min，混合均匀后，将溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交联仪中，用紫外光进行光照4h交联成膜，所述紫外灯的功率密度为60μw/cm2，紫外线的波长为282.3nm，取出自然晾干，得乙烯基改性鱼鳞蛋白膜。
实施例5
本发明提供了一种乙烯基改性鱼鳞蛋白膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)本发明还提供了所述鱼鳞胶原蛋白的制备方法为：将鱼鳞依次用碳酸钠溶液、乙酸-乙酸钠缓冲液中、氢氧化钠溶液和酶制剂处理，将酸处理和碱处理后的加入20倍量水中，调节控制ph值在7.2、温度在55℃，加入木瓜蛋白酶，该木瓜蛋白酶与滤渣比例为2.8∶100，搅拌1.2h，保温3h，然后灭活木瓜蛋白酶；控制ph值在2.0、温度在60℃下加入胰蛋白酶，该胰蛋白酶与滤渣比例为2.5∶100，搅拌2h后，灭活胰蛋白酶，过滤干燥后，即得到鱼鳞胶原蛋白。将鱼鳞胶原蛋白溶解于乙酸-乙酸钠缓冲液中，得胶原蛋白溶液；
(2)在水浴条件下将甲基丙烯酸酐滴加到胶原蛋白溶液中，然后加入谷氨酰胺转氨酶，在60℃下反应8h，得到乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液；
所述甲基丙烯酸酐与所述胶原蛋白的质量比为1：10；和所述谷氨酰胺转氨酶与所述胶原蛋白的质量比为0.05：1；
(3)向步骤(2)的乙烯基改性鱼鳞蛋白乳液中加入光引发剂安息香及其衍生物，所述光引发剂安息香及其衍生物的在混合体系中的浓度为0.02％，在55℃下超声波震荡20min，混合均匀后，将溶液倒入聚四氟乙烯的模具中，放置在紫外交联仪中，用紫外光进行光照4h交联成膜，所述紫外灯的功率密度为60μw/cm2，紫外线的波长为324.5nm，取出自然晾干，得乙烯基改性鱼鳞蛋白膜。
上述描述仅是对本发明部分实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本行业的普通技术人员可根据本发明对上述实施例做出改进或修改，但均属于本发明保护范围。