稻瘟病菌LAMP检测引物组及应用的制作方法

本发明涉及植物病害快速预警技术，属于植物保护学科中的病害预测预报研究与应用领域。

背景技术：

稻瘟病是我国各水稻产区最主要的病害之一，在水稻整个生育期均可发生，对水稻的产量和品质均可造成严重的影响。特别是穗瘟往往会造成田间出现大量枯白穗，甚至绝收。若不能适时有效的施用化学农药，不仅难以控制病害的发生，还会因大量频繁的使用化学农药而使病原菌产生抗药性，并导致农药残留和对环境的污染。对病害的精准预报是适时施药和有效控病的基础，但已有的病害预测预报方式主要靠专家在田间系统的大面积调查，然后根据经验发表病害情报，不仅费时费力，且因整合多地资料也需要时间，再加上栽培方式的多样化，各田块作物的生育期并不一致，从而导致生产上经常出现过早或过迟施用农药的现象，防病效果并不理想。因此，发展快速实时的病害预测预报方法，对指导农民用药，有效控制病害具有重要意义。

lamp技术是特定的针对病原物靶基因的某区域设计特异引物，在链转换dna聚合酶的作用下，特异、痕量检测样品中的dna。该方法操作简单、特异性强、产物易检测，且不需要昂贵的试剂和精密高质的仪器，在作物病害早期预警上有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速检测稻穗中稻瘟病菌带菌率的技术，对稻瘟病的发生与防控进行实时预警。本发明中，基于稻瘟病菌bt1基因序列利用在线软件primerexplorerv设计的引物组具有特异高效扩增稻瘟病菌的特性，可检测未显症稻穗的带菌率，根据带菌率与后期病害严重度的相关性，可对稻穗瘟的发生作物实时预警。

本发明公开了一组稻瘟病菌lamp检测引物，该组引物组成如下：

btf3-19：5′-acgtccagaacaagaactcg-3′(seqidno.19)

btfip-19：5′-ctgctgtagaactccggcccccaacaacatccagacc-3′(seqidno.24)

btbip-19：5′-ggatggcagtcgagtttccgatcactcgtcaagtgacggta-3′(seqidno.31)

btb3-19：5′-caagtccgcgttccgaaa-3′(seqidno.32)。

本发明所述引物组能特异检测稻瘟病菌基因组dna。

本发明还公开了上述引物组在稻瘟病实时预警上的应用。

本发明还公开了一种稻瘟病菌lamp检测方法。

引物组合19是根据稻瘟病菌bt1基因序列设计的可专化性扩增稻瘟病菌基因组dna的特异引物，对水稻其它病原菌无扩增条带。该检测反应的最优条件为63℃下反应40min，在此反应条件下可检测到的稻瘟病菌dna量可达pg级。利用此引物组和反应条件，检测得的稻穗带菌率与后期病害严重度呈显著正相关，相关系数达0.7395～0.9194，说明该方法可以用于田间稻瘟病的实时预警。

附图说明

图1不同btf3/btb3引物对扩增稻瘟病菌dna产物电泳图。

图2qpcr方法检测引物对的灵敏度

图3qpcr方法检测引物对的特异性。

图4引物组19对稻瘟病菌dna的lamp检测反应。pp19和pp22分别表示引物对19和引物对22。

图5qpcr和lamp方法检测灵敏度比较；a：qpcr方法，1～6分别表示dna底物梯度浓度为5.9×10²～5.9×10^-3ng；b：lamp方法，a～g分别表示dna底物梯度浓度为5.9×10²～5.9×10^-4ng。

图6lamp检测带菌率与田间后期稻穗瘟病穗率相关性。a：2015年，b：2016年。

具体实施方式

1、特异性引物的设计与筛选

(1)根据稻瘟病菌bt1基因序列(登录号：xm_003718381)，利用在线软件primerexplorer设计lamp检测引物组，选择其中23组引物进行特异性测定(表1)。

表1据稻瘟病菌bt1基因序列设计的部分lamp引物组

(2)用23对btf3/btb3引物对稻瘟病菌基因组dna进行pcr扩增，共有9对引物可以从稻瘟病菌中扩增出单一条带，且扩增效果较好的为第19对(btf3-19(seqidno。19)/btb3-19(seqidno。24))和第22对(btf3-22(seqidno。25)/btb3-22(seqidno。30))引物(图1)。

2、特异性与灵敏度检测

(1)qpcr结果表明，引物对btf3-19/btb3-19在进行24个循环后就可以检测到病原菌dna，而引物对btf3-22/btb3-22需进行34个循环左右(图2)。

(2)用水稻其它常见病原菌如水稻纹枯病菌(rhizoctoniasolnai)、恶苗病菌(fusariumfujikuroi)和稻曲病菌(ustilaginoideavirens)等来检测引物对btf3-19/btb3-19的专化性发现，引物对btf3-19/btb3-19只能对稻瘟病菌dna进行扩增，其它几种菌均表现阴性，说明引物对btf3-19/btb3-19可以用来进行稻瘟病菌dna的特异性检测(图3)。

(3)用引物组19(btf3-19/btfip-19/btbip-19/btb3-19)进行lamp检测，加入稻瘟菌dna的pcr管呈现绿色(阳性)，而加入水稻纹枯病菌dna和稻曲病菌dna的pcr管显褐色(阴性)(图4)。

fip和bip是primerexplorer中对引物的特定命名，fip为引物f1c和f2序列的结合，bip是b1c和b2序列的结合。f1c是f1的互补序列，b1c为b1的互补序列。所以依据表1，btfip-19及btbip-19序列如下：

btfip-19：5′-ctgctgtagaactccggcccccaacaacatccagacc-3′(seqidno.31)

btbip-19：5′-ggatggcagtcgagtttccgatcactcgtcaagtgacggta-3′(seqidno.32)

(4)将浓度为5.9×10²ng的稻瘟病菌基因组dna进行梯度稀释后，分别进行qpcr和lamp检测，结果表明lamp检测灵敏度可达到5.9pg/ml(管a到管f均显示绿色，仅管g显示褐色，图5b)，比qpcr灵敏度高10倍(图5a)。

3、该技术在稻穗瘟病预警上的应用

于2015和2016年在同一地区分别于6块不同田块中取始穗期稻穗100穗，检测其带菌率，30d后5点取样法调查各田块病穗率，每点100穗。结果表明，经lamp检测的稻穗带菌率与后期田间病穗率呈显著正相关，尽管2016年田间发病较轻，但相关性趋势仍然一致，说明该种方法可用于稻穗瘟的预警(图6)。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>稻瘟病菌lamp检测引物组及应用

<130>

<160>32

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ctatggtggtgtcggcacctt21

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<212>dna

<213>人工序列

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cactcgtcaagtgacggta19

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ctgctgtagaactccggcccccaacaacatccagacc37

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<400>32

ggatggcagtcgagtttccgatcactcgtcaagtgacggta41