一种FcγRIIb基因敲除的MDSC及其作为抗肿瘤药物的应用的制作方法

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种fcγriib基因敲除的mdsc及其作为抗肿瘤药物的应用。

背景技术：

肿瘤发生时共同髓系祖细胞分化过程受阻，造成处于不同分化阶段的髓系祖细胞及未成熟髓系细胞大量扩增并活化为具有免疫抑制功能的髓源性抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcell,mdsc)，在骨髓、外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤组织中大量聚集。mdsc主要通过抑制t细胞发挥其强大的免疫抑制功能，如通过表达精氨酸酶和诱导型一氧化氮合成酶(inos)抑制t细胞增殖；通过分泌il-10或tgf-β诱导调节性t细胞产生。动物实验和临床研究均表明，mdsc扩增与多种肿瘤的预后呈负相关，并降低肿瘤免疫治疗的效果。因而，调控mdsc的分化及表型功能是肿瘤免疫治疗的新策略。新近的研究显示：在特定情况下，如抗磷脂酰丝氨酸抗体能够诱导肿瘤组织中mdsc向免疫刺激表型极化；使用shp-1抑制剂，肿瘤组织和脾脏中mdsc均能极化为免疫刺激表型并进行抗肿瘤应答。因此，改变mdsc的极化状态，使其向免疫刺激表型极化是肿瘤免疫治疗的新思路。

技术实现要素：

本发明提供一种fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)的mdsc。

本发明的另一实施方案提供上述fcγriib基因敲除的mdsc的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

给fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)小鼠皮下注射1×10⁶个肺癌细胞株3ll细胞或黑色素瘤细胞株b16f10细胞，3周后无菌分离获取小鼠脾脏，用无菌针芯将脾脏磨碎，经400目钢网滤过并收集单细胞，tris-nh4cl裂解红细胞，pbs洗涤2遍，cd11b磁珠4℃标记15min后，过分选柱阳性选择cd11b⁺细胞，即可制备得到fcγriib基因敲除的mdsc。

上述制备方法中fcγiirb^-/-小鼠优选c57bl/6背景的小鼠。

上述制备得到的fcγriib基因敲除的mdsc经流式细胞仪检测cd11b⁺gr-1⁺mdsc纯度在90％以上。

本发明的另一实施方案提供上述fcγriib基因敲除的mdsc在制备抗肿瘤药物中的应用。所述抗肿瘤药物优选用于预防和/或治疗肺癌、黑色素瘤。

本发明所述的pbs的制备方法：将nacl(16g)、nahpo4(5.78g)、kh2po4(0.27g)和kcl(0.4g)溶于2000ml三蒸水中，用盐酸调ph至7.4，高压灭菌，4℃保存备用。

本发明所采用的具体方法是：分别给野生(wildtype,wt)小鼠和fcγriib基因敲除(fcγiirb^-/-)小鼠皮下注射1×10⁶个肺癌细胞株3ll细胞或黑色素瘤细胞株b16f10细胞，3周后取小鼠的脾脏，免疫磁珠分选cd11b⁺gr-1⁺mdsc。部分mdsc裂解后检测精氨酸酶活性，部分mdsc铺板后24小时，收集上清，检测上清中一氧化氮(no)、il-10和tnf-α的分泌情况。结果在两种荷瘤模型中均发现：与wtmdsc相比，fcγiirb^-/-mdsc精氨酸酶活性和il-10分泌明显下降，inos活性和tnf-α分泌明显增高，提示fcγriib缺陷诱导mdsc向免疫刺激型极化。为了进一步证实fcγiirb^-/-mdsc具有抗肿瘤效应，分别给wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠皮下注射1×10⁶个3ll细胞，3周后取小鼠的脾脏，磁珠分选wtmdsc和fcγiirb^-/-mdsc，备用。给c57bl/6小鼠皮下注射1×10⁵个3ll细胞，在注射3ll细胞后的第7天、第14天和第21天分别给荷瘤小鼠静脉过继回输wtmdsc和fcγiirb^-/-mdsc，同时设静脉注射pbs缓冲液的对照。检测荷瘤小鼠肿瘤的生长情况。结果发现：过继回输wtmdsc可促进肿瘤生长，而过继回输fcγiirb^-/-mdsc则延缓肿瘤的生长(图1)，提示fcγiirb^-/-mdsc具有抗肿瘤效应。

本发明首次提出fcγiirb在mdsc向免疫刺激表型极化过程中发挥重要的调控作用，从而影响肿瘤的进展，为研制以fcγiirb为靶标的新型肿瘤防治手段提供基础。

附图说明

图1fcγriib^-/-b16f10荷瘤小鼠mdsc细胞因子分泌情况

图2fcγriib^-/-3ll荷瘤小鼠mdsc细胞因子分泌情况

图3fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾脏mdsc具有抗肿瘤效应

图4fcγriib缺陷降低3ll荷瘤小鼠的死亡率

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

有关原材料说明：

(1)3ll和b16f10细胞株来自美国菌种保藏中心(americantypeculturecollection,atcc)，由本室保种。

(2)小鼠cd11b分选磁珠购自德国美天妮公司。

(3)il-10和tnf-α的elisa检测试剂盒购自达科为公司。

(4)c57bl/6小鼠购自扬州大学比较医学中心。

(5)fcγiirb基因缺陷小鼠来源于美国jackson实验室，由本室保种。

(6)检测一氧化氮的griess试剂购自美国sigma公司。

(7)检测精氨酶酶活性的试剂盒购自美国bioassay公司。

(一)fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾脏mdsc向免疫刺激表型极化

(1)mdsc的获取

分别给c57bl/6背景的wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠背部皮下注射1×10⁶个3ll细胞或b16f10细胞，3周后无菌分离获取小鼠脾脏，用无菌针芯将脾脏磨碎，经400目钢网滤过并收集单细胞，tris-nh4cl裂解红细胞，pbs洗涤2遍，cd11b磁珠4℃标记15min后，过分选柱阳性选择cd11b⁺细胞，经流式细胞仪检测cd11b⁺gr-1⁺mdsc纯度在90％以上。

(2)mdsc精氨酸酶和分泌细胞因子检测

取1×10⁶个mdsc，用细胞裂解液裂解后，利用bioassay公司的精氨酸酶检测试剂盒检测精氨酸酶活性。另将磁珠分选得到的mdsc用含10％fbs的1640培养液重悬至1×10⁶/ml的密度，铺至细胞培养板中，24小时后，收集上清，griess试剂检测上清中no的水平，elisa法检测il-10和tnf-α的表达水平。在来源于3ll和b16f10荷瘤小鼠的mdsc中均发现，与wtmdsc相比，fcγiirb^-/-mdsc精氨酸酶活性和il-10分泌明显下降，inos活性和tnf-α分泌明显增高(图1、图2)，提示fcγriib缺陷诱导mdsc向免疫刺激型极化。

(二)fcγriib缺陷荷瘤小鼠脾脏mdsc具有抗肿瘤效应

(1)mdsc的获取

分别给c57bl/6背景的wt小鼠和fcγiirb^-/-小鼠背部皮下注射1×10⁶个3ll细胞，3周后无菌分离获取小鼠脾脏，用无菌针芯将脾脏磨碎，经400目钢网滤过并收集单细胞，tris-nh4cl裂解红细胞，pbs洗涤2遍，cd11b磁珠4℃标记15min后，过分选柱阳性选择cd11b⁺细胞，经流式细胞仪检测cd11b⁺gr-1⁺mdsc纯度在90％以上。

(2)mdsc过继回输给3ll成瘤小鼠

给c57bl/6小鼠皮下注射1×10⁵个3ll细胞，在注射3ll细胞后的第7天、第14天和第21天分别给荷瘤小鼠静脉过继回输(1)中磁珠分选得到的5×10⁶个wtmdsc或fcγiirb^-/-mdsc，同时设静脉注射pbs的对照。检测荷瘤小鼠肿瘤的生长情况。结果发现：过继回输wtmdsc可促进肿瘤生长，而过继回输fcγiirb^-/-mdsc则延缓肿瘤的生长，提示fcγiirb缺陷后的mdsc具有抗肿瘤效应(图3)。

(3)fcγriib缺陷降低3ll荷瘤小鼠的死亡率

在检测3ll肿瘤生长情况的同时，我们同样观察了wt和fcγiirb-/-荷瘤小鼠的死亡情况。结果发现：与wt小鼠相比，fcγiirb-/-小鼠死亡率明显下降，提示fcγiirb缺陷对小鼠肿瘤致死有保护作用(图4)。